Microscopia Atômica da Força: Imagem Lactente Quantitativa de Amostras Biológicas de Vida usando PeakForce QNM

Por AZoNano

Índice

Introdução
Mecânicos do AFM e da Pilha
Quantificação Fácil, De alta resolução de Propriedades Mecânicas da Amostra
Quantificação Directa de Sinais do AFM em Amostras Biológicas
Amostras Biológicas da Imagem Lactente com PeakForce QNM
Dinâmica da Pilha da Monitoração no Tempo Real
AFM de Cobertura e Canais Ópticos
Conclusão
Sobre Bruker

Introdução

É um facto conhecido de que determinar as propriedades mecânicas de pilhas vivas ex vivo pode indicar a saúde do organismo de que foram extraídas. Particularmente do modo da força, o AFM reage uma ferramenta diagnóstica e de investigação poderosa. A espectroscopia da Força tem muitas desvantagens tais como menos definição, velocidade da aquisição, e não fornece a informação quantitativa necessário. PeakForce QNM foi desenvolvido por Bruker para oferecer dados informativos na alta resolução com acessibilidade notável.

Mecânicos do AFM e da Pilha

Desde sua revelação, o AFM é uma ferramenta da escolha às amostras biológicas macias super da imagem, especialmente com a emergência da espectroscopia de TappingMode™ e de força e do facto de que é uma de poucas técnicas da microscopia que permite a observação das pilhas sob circunstâncias próximo-fisiológicos. O AFM é usado frequentemente correlacionar o comportamento e a migração ou a divisão elástica da pilha. A grande maioria destes estuda é baseada em TappingMode, em curvas da único-força, ou em medidas do força-volume.

TappingMode oferece a vantagem de aplicar forças insignificantes do substantivo, da fricção e de tesoura, e a imagem lactente da fase reflecte a energia dissipada entre a ponta e a amostra durante cada torneira na superfície. O volume da Força é uma outra técnica poderosa baseada nas medidas da força conseguidas em uma matriz dos pontos definidos pelo usuário. A Rigidez e a adesão entre a ponta e a amostra podem ser extraídas de cada curva da força. Caso que a ponta functionalized com uma molécula do interesse, o específico que desata eventos pode igualmente ser identificado na curva da retração. Para superar estes gargalos, Bruker desenvolveu PeakForce QNM.

Quantificação Fácil, De alta resolução de Propriedades Mecânicas da Amostra

PeakForce QNM permite a extracção directa da informação nanomechanical quantitativa das amostras biológicas sem danificar a amostra. Tem com base na tecnologia de Batida da Força Máxima, durante que a ponta de prova está oscilada de forma semelhante enquanto está em TappingMode, mas em distante abaixo da freqüência da ressonância (1 ou 2 quilohertz segundo a ferramenta). Cada vez que a ponta e a amostra são reunidas, uma curva da força está capturada. Contudo, onde o laço de feedback mantem a amplitude de batida constante em TappingMode, controles de Batida Máximos da Força a força máxima máxima na ponta de prova. Estas forças podem ser controladas a níveis muito mais baixos do que o modo de contacto e mesmo abaixar do que TappingMode permitindo a operação mesmo nas amostras biológicas as mais delicadas.

Figura 1 mostra os campos de força diferentes experimentados pela ponta de prova durante ciclo do aproximação-retraimanto, assim como toda a informação que pode ser extraída da força gerada se curva. Quando a ponta de prova aproxima a amostra (figura 1a), puxou para baixo para a superfície pelas forças atractivas, que são principalmente capilares, Van der Waals e as forças electrostáticas. No ponto B, aquelas forças negativas tornam-se mais altamente do que a rigidez do modilhão, que faz com que a ponta puxe para a superfície e comece então recortar na amostra até que a Z-Posição da modulação alcance seu máximo (ponto C). Esta posição representa o valor máximo máximo da força, que é usado para o controle de feedback. Após este ponto, a ponta de prova começa retirar-se até que alcance o ponto da tracção-fora (o ponto máximo da adesão, que igualmente corresponde à força mínima). Então a ponta continua a retrair e alcança de volta a sua posição original (e) onde (como A) em não mais campo de força afecta seu movimento.

Figura 1. princípio de Funcionamento de PeakForce QNM. Quando a ponta de prova for oscilada, uma curva da força está gravada para cada pixel da imagem. Para distinguir entre as parcelas diferentes da trajectória da ponta, este exemplo foi gravado usando uma ponta de prova de TAP150A, que fosse usada tipicamente à imagem amostras um pouco duras e deficientemente complacentes. Em amostras biológicas, a força máxima típica pode estar até mil vezes mais baixo.

Este modelo dos mecânicos supor que o princípio do contacto permanece o mesmo que no modelo Hertzian mas considera interacções atractivas adicionais focalizadas dentro de um anel situado fora da área de contacto (figura 2a). Nesse caso, e considerando o contacto entre uma esfera e um metade-espaço elástico, a força é relacionada à deformação perto:

onde E* representa o módulo, o R o raio da ponta e o d Young reduzidos a profundidade da deformação.

Eventualmente, a energia dissipada pela ponta e a amostra durante cada torneira na superfície são obtidas integrando a área entre a aproximação e as curvas da retração.

Quantificação Directa de Sinais do AFM em Amostras Biológicas

Quando a ponta de prova é calibrada antes da experiência, todos os sinais mencionados acima serão directamente quantitativos. Esta calibração pode ser feita como segue:

  1. Contrate uma parte dura da amostra (como o vidro) e grave uma curva da força de que a sensibilidade de deflexão pode ser calculada.
  2. Retire e calcule a constante da mola usando “o Acordo Térmico”.
  3. Grave uma imagem da topografia da amostra de Tipcheck para obter um valor do raio R. da ponta.
  4. Após ter incorporado o valor calculado de R, a deformação é ajustada em uma amostra de escolha. A amostra a ser feita a varredura deve ter propriedades mecânicas similares como a amostra biológica que será investigada durante a experiência.

Em a maioria das amostras testadas, um ajuste de Sneddon foi usado para extrair o módulo Young capturando uma lima de HSDC (Captação de Dados De alta velocidade) em uma linha de varredura em um muito de alta resolução. Quando os perfis da força e da altura são comparados, as peças não-desejadas (as curvas da força capturaram em uma parcela da amostra que não é do interesse, tal como o vidro) podem ser excluídas manualmente. As curvas da força restante podem ser exportadas como uma única lima, cargo-processada por um programa externo, e o módulo Young médio pode ser calculado considerando teorias diferentes do contacto, tais como o o modelo de Sneddon.

Esta teoria mecânica considera o contacto entre um metade-espaço elástico deformado por um indenter cónico rígido (figura 2b), determinando que a carga é proporcional ao quadrado da profundidade de penetração. A profundidade do recorte e o raio da ponta são relacionados perto:

Figura 2. mecânicos do Contacto no AFM. Em a, o ajuste do DMT é baseado em uma suposição Hertzian mas indica que as forças da adesão estão focalizadas fora da área de contacto. Isto é adaptado bem aos polímeros high-density e às amostras deficientemente deformable. Em b, o ajuste de Sneddon considera a ponta como um indenter cónico infinito, que seja adaptado bem às amostras macias (biológico) e deformable.

Em tais amostras, uma vasta gama de pontas de prova do AFM foi testada e a recomendação é dada em figura 3. As pontas de prova existentes as mais macias no mercado são OBL-B, que têm uma constante nominal da mola de 0,006 N/m e são assim apropriados para investigar pilhas vivas macias super, tais como os neurônios.

Figura 3. Escala da conformidade de várias amostras biológicas e das pontas de prova correspondentes do AFM recomendadas para a Batida Máxima da Força. Segundo seu tipo, as pilhas eucarióticas podem exibir propriedades mecânicas muito diferentes. Os Neurônios podem ser extremamente macios (para baixo a 1kPa) visto que a pilha de osso pode ser tão robusta quanto as bactérias. A fim sondar correctamente as propriedades da pilha, selecionando a mola direita constante e assim a sensibilidade é imperativa.

Amostras Biológicas da Imagem Lactente com PeakForce QNM

As amostras biológicas Marinhas são compor frequentemente de uma mistura de componentes macios e rígidos. Uma amostra de água tomada do Mar de Adriático foi posta sobre uma placa de vidro e investigada por PeakForce QNM. A não ser observações muito relevantes nas diatomáceas vivas, alguns restos da parede de pilha foram encontrados igualmente na suspensão. Figura 4 dá um exemplo como aquelas estruturas olham. O perfil 3D-topography revela uma característica waffle-como a estrutura com poros 100 nanômetro em tamanho e uma altura média de 20 nanômetro. O canal da adesão mostra um contraste marcado entre a parte inferior dos poros (aproximadamente 50 pN na média) e o resto da parede de pilha (menos de 20 pN). Contudo, os canais os mais informativos são a elasticidade e os dados da deformação. Em ambos os canais as três parcelas do frustule são distintas, cada um que exibe propriedades mecânicas claramente diferentes: o centro do poro (módulo Young médio do kPa ~300 e da deformação média de ~7 nanômetro), o anel em torno do poro (~75 kPa e ~25 nanômetro) e a peça do núcleo da parede de pilha, que parecem ter propriedades mecânicas intermediárias (~200 kPa e ~10 nanômetro).

Figura 4. Imagem Lactente da parede de pilha do fitoplâncton com um Catalizador AFM do BioScope. Superior esquerdo: imagem de uma diatomácea, cortesia da microscopia de elétron da amostra de Dennis Kunkel, Astrographics. A Maioria dos canais de PeakForce QNM fornecem um contraste notável e umas características de alta resolução.

As experiências Adicionais foram realizadas nas bactérias de Escherichia Coli K12. Ao Contrário da maioria de espécies de Escherichia Coli, as tensões K12 podem multiplicar no intestino e são particularmente resistentes aos anticorpos. Uma de suas outras características é que possuem o pili (veja a figura 5a) que retraia tipicamente sob circunstâncias da prostração ou todo o ambiente de sublinhação. Até aqui, a imagem lactente aquelas bactérias vivas com o AFM, em todo o modo, foi um desafio considerável e um resultado historicamente indescritível.

Figura 5 mostra as imagens de alta resolução de tais bactérias vivas, obtidas facilmente em menos de uma hora. Como pode ser visto no 3D-representation do canal da altura (figura 5b), o pili é já não visível, que pode ser explicado pelo facto de que extraindo de seu media da suspensão e espalhando o em um prato induz um esforço que faça com que àqueles o pili retraia. A Figura 5c mostra o canal do módulo do DMT. Usando um ajuste de Sneddon, o módulo Young médio foi determinado ser o kPa 183, que combina perfeitamente observações precedentes.

Figura 5. bactérias de Escherichia Coli K12 imaged por PeakForce QNM em um Catalizador AFM do BioScope. Em a, a estrutura da tensão é desenhada. Em b, uma representação 3D-height do AFM 10x10μm de um conjunto de bactérias é mostrada. Em c, canal Young do módulo (z-escala: 0-4GPa) é descrito. Isto é a primeira vez que tais bactérias estiveram vivas imaged pelo AFM.

Dinâmica da Pilha da Monitoração no Tempo Real

Todas As pilhas vivas são dinâmicas, deformar devido ao rearranjo de seu andaime do cytoskeleton e espalhar e migrar na carcaça da cultura celular. Estes processos e as mudanças mecânicas que os acompanham podem ser monitorados usando o PeakForce QNM. Em um outro grupo de experiências, PeakForce QNM foi usado para investigar pilhas do glioblastoma. Glioblastoma é por muito o formulário o mais comum e o mais maligno do cancro cerebral. As pilhas Vivas do glioblastoma foram imaged por PeakForce QNM no Catalizador do BioScope e por vivo mantido pela época da experiência pelo uso da LIBRA POR POLEGADA QUADRADA. Esta tecnologia permite que o usuário aplique um muito delicado à força moderado na amostra, segundo a informação necessário. Ao aplicar uma força muito clara na amostra, as características o mais elevado da pilha (glycocalyx, saliências) podem ser sondadas. Por outro lado, uma força ligeira mais alta é exigida para detectar os organelles e o cytoskeleton situados debaixo da membrana de plasma. Sondar as propriedades mecânicas reais da amostra igualmente exige o recorte da amostra (e dobre assim no modilhão) pelo menos por cem nanômetros. Figure que mostras que 6a uma imagem de alta resolução típica obteve em glioblastoma vivo ao aplicar uma força moderado (~300 pN).

Figura 6. Imagens de pilhas vivas do glioblastoma por PeakForce QNM e o Catalizador AFM do BioScope. Em a, a imagem da altura de 40x40μm gravada em uma força moderado mostra estruturas o mais elevado e internas. Em b, a folha de prova 3D de 15x15μm dos canais da topografia e da deformação é mostrada. O Catalizador do BioScope de Bruker com Perfusing a Incubadora da Fase oferece o melhor balanço da imagem lactente da pilha viva para experiências a longo prazo.

Keratinocytes é os componentes principais da camada ultraperiférica da pele humana. Estudando tais pilhas por pesquisadores das ajudas do AFM compreenda o processo de cancro de pele ou de outros prejuízos.

HaCat é uma linha celular imortal de keratinocytes humanos que seja investigada extensamente na citologia e igualmente represente um bom candidato para explorar o potencial de PeakForce QNM. As pilhas foram expor a um agente oxidativo capaz de induzir um esforço. Em resposta a esta agressão química, as pilhas tendem a transformar e sintetizar fibras de esforço assim chamadas do actínio. Uma imagem média típica da definição é mostrada em figura 7.

Figura 7. imagem do Catalizador e do PeakForce QNM do BioScope de 75x75μm de pilhas de vida de HaCat sob o esforço oxidativo. As pilhas reagem ràpida sintetizando fibrilas do esforço para estabelecer contactos com pilhas adjacentes. Tais processos dinâmicos podem igualmente ser seguidos usando esta técnica.

Em PeakForce QNM, uma curva da força é feita para cada pixel da imagem, assim a definição está a mesma em todos os canais. Este exemplo ilustra como fácil e jejua (as imagens da definição do pixel 384x384 podem ser capturadas em 6 a 9 minutos) ele é a directamente e na maneira quantitativa uma ponta de prova muda na topografia e em propriedades mecânicas de pilhas vivas em resposta aos tratamentos da droga.

AFM de Cobertura e Canais Ópticos

Outros dos desafios chaves actuais para aplicações biológicas são poder obter simultaneamente informação óptica e do AFM. A característica exclusiva do Registo e da Folha De Prova da Imagem do Microscópio de Bruker (MIRO™) pode ser usada para importar facilmente imagens ópticas/fluorescência no software de NanoScope® e para overlay as com imagens do AFM. Após uma calibração curto, o usuário pode seleccionar o lugar para fazer o AFM fazer a varredura. Assim a amostra automaticamente pode ser movida para a posição desejada e a imagem do AFM pode ser pixel capturado pelo pixel, e integrado inteiramente na imagem óptica.

Figura 8 mostra uma folha de prova conseguida em pilhas endothelial de vida. A imagem da fluorescência (dobro-manchando DAPI para o núcleo e o á-phalloidin para filamentos do actínio) é ajustada como o fundo e sobrepor com uma imagem do AFM feita de uma mistura de dois canais: erro máximo da força e módulo Young. A transparência foi ajustada em 50% de modo que uma correlação directa pudesse ser feita entre as partes diferentes das pilhas (visíveis pela topografia e pela fluorescência do AFM) e suas propriedades mecânicas correspondentes (canal Young do AFM do módulo). Em b, c e d o erro máximo individual da força, o módulo Young e as imagens do AFM da deformação são representados. Pode-se claramente ver na elasticidade e os canais da deformação que nas bordas das pilhas onde a espessura é demasiado baixa, a influência do andaime (vidro) nas propriedades mecânicas da amostra são não insignificantes, visto que na peça do núcleo das pilhas, o módulo Young médio é muito mais seguro (kPa 45,3). Para uma matéria da claridade, somente três canais do AFM são mostrados aqui, mas oito sinais diferentes podem ser indicados simultaneamente.

Figura 8. Folha De Prova da fluorescência e imagens do AFM das pilhas de vida de HUVEC criadas com o MIRO em um Catalizador do BioScope. O benefício principal de MIRO é permitir simultaneamente o indicador da informação óptica e do AFM. Ao operar-se com pontas de prova functionalized, do “uma opção Ponto & do Tiro” pode igualmente ser usada para provocar exactamente a medida da força em lugar desejados sem perder a ligante.

Conclusão

As aplicações mostradas acima demonstram que a Batida da Força do Pico é por muito a mais poderosa e hoje disponível da técnica quantitativa do AFM da alta resolução para sondar o produto químico quantitativo e propriedades mecânicas de amostras biológicas de vida com uma aquisição apressa comparável a TappingMode. O número de propriedades mecânicas diferentes que podem ser caracterizadas excede aquele de outros modos de uso geral do AFM. Seu potencial pavimenta a maneira para muitas novas aplicações emocionantes no campo da biologia, especialmente na investigação do cancro e em doenças cardiovasculares.

Sobre Bruker

As Superfícies Nano de Bruker fornecem os produtos Atômicos do Microscópio da Força/do Microscópio Ponta De Prova da Exploração (AFM/SPM) que estão para fora de outros sistemas disponíveis no comércio para seus projecto e acessibilidade robustos, enquanto mantendo o mais de alta resolução. A cabeça de medição de NANOS, que é peça de todos nossos instrumentos, emprega um interferómetro original da fibra óptica para medir a deflexão do modilhão, que faz o estojo compacto da instalação assim que é não maior do que um objetivo padrão do microscópio da pesquisa.

Esta informação foi originária, revista e adaptada dos materiais fornecidos por Superfícies Nano de Bruker.

Para obter mais informações sobre desta fonte, visite por favor Superfícies Nano de Bruker.

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:25

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