Атомная Микроскопия Усилия: Количественное Воображение Живя Биологических Образцов используя PeakForce QNM

AZoNano

Содержание

Введение
Механики AFM и Клетки
Легко, Квантификация Высок-Разрешения Свойств Образца Механически
Сразу Квантификация Сигналов AFM на Биологических Образцах
Образцы Воображения Биологические с PeakForce QNM
Динамика Клетки Контроля в Реальное Временя
Overlaying AFM и Оптически Каналы
Заключение
О Bruker

Введение

Известный факт что определять механически свойства живущих клеток ex vivo может показать здоровье организма от которого они были извлечены. В Частности в режиме усилия, AFM мощный диагностический и investigational инструмент. Спектроскопия Усилия имеет много недостатки как меньше разрешения, скорость приема, и она не обеспечивает необходимую количественную информацию. PeakForce QNM было начато Bruker для того чтобы предложить информативные данные на высоком разрешении с замечательным легкием в использовании.

Механики AFM и Клетки

С своего развития, AFM инструмент выбора к образцам изображения супер мягким биологическим, специально с эмерджентностью спектроскопии TappingMode™ и усилия и факта что он один из немногих методов микроскопии который позволяет замечанию клеток под близко-физиологопсихологическими условиями. AFM часто использован для того чтобы сопоставить эластичные поведение и переселение или разделение клетки. Подавляющее большинство этих изучает основано на TappingMode, кривых одиночн-усилия, или измерениях усили-тома.

TappingMode предлагает преимущество прикладывать незначительные усилия nominal, трения и ножниц, и воображение участка отражает энергию рассеиванную между подсказкой и образцом во время каждого крана на поверхности. Том Усилия другой мощный метод основанный на измерениях усилия достиганных на матрице пунктов определенных пользователем. Жесткость и прилипание между подсказкой и образцом можно извлечь от каждой кривого усилия. В случае если подсказка functionalized с молекулой интереса, специфические unbinding случаи можно также определить на кривом стягивания. Для того чтобы отжать эти bottlenecks, Bruker начинало PeakForce QNM.

Легко, Квантификация Высок-Разрешения Свойств Образца Механически

PeakForce QNM включает сразу извлечение количественной nanomechanical информации от биологических образцов без повреждать образец. Оно основывал на технологии Пикового Усилия Выстукивая, во время которой зонд осциллирован в подобном способе по мере того как он в TappingMode, но на далеко под частотой резонанса (1 или 2 КГц в зависимости от инструмента). Каждый раз подсказка и образец принесены совместно, кривый усилия захвачена. Однако, где цепь обратной связи поддерживает выстукивая амплитуду постоянн в TappingMode, управления Пикового Усилия Выстукивая максимальное пиковое усилие на зонде. Эти усилия можно контролировать на уровнях гораздо низкее чем режим контакта и даже понизить чем TappingMode позволяющ деятельности на даже самых чувствительных биологических образцах.

На Диаграмму 1 показано различные поля усилия испытанные зондом во время цикла подход-втягивать, так же, как всей информации которую можно извлечь от произведенного усилия изгибает. Когда зонд причаливает образцу (диаграмме 1a), он вытягивал вниз к поверхности привлекательными усилиями, которые главным образом капилляр, Van der Waals и силы электростатического поля. На этап B, те отрицательные усилия становят более высоко чем жесткость cantilever, которая причиняет подсказку вытянуть к поверхности и после этого начать выделить в образец до тех пор пока Z-Положение модуляции не будет достигать свой максимум (пункт C). Это положение представляет максимальное пиковое значение усилия, которое использовано для управления с обратной связью. После этого пункта, зонд начинает разделить до тех пор пока он не будет достигать пункт тяги- (максимальный пункт прилипания, который также соответствует к минимальному усилию). После Этого подсказка продолжается вытянуть и достигается назад к своему первоначально положению (E) где (как в A) никакое больше поля усилия не влияет на свое движение.

Диаграмма 1. принцип Деятельности PeakForce QNM. Пока зонд осциллирован, кривый усилия записана для каждого пиксела изображения. Различил между различными частями траектории подсказки, этот пример были записаны, что путем использование зонда TAP150A, который типично использован к изображению довольно жесткие и бедно уступчивые образцы. На биологических образцах, типичное пиковое усилие может быть до тысяча времен более низко.

Эта модель механиков предполагает принцип контакта остает этим же как в Hertzian модели но рассматривает дополнительные привлекательные взаимодействия сфокусировано внутри annulus расположенного вне площади контакта (диаграммы 2a). В таком случае, и принимая во внимание контакт между сферой и эластичным полупространством, усилие отнесено к деформации мимо:

где E* представляет уменьшенные Young модуль, R радиус подсказки и d глубина деформации.

Окончательно, энергия рассеиванная подсказкой и образец во время каждого крана на поверхности получены путем интегрировать зону между подходом и кривыми стягивания.

Сразу Квантификация Сигналов AFM на Биологических Образцах

Когда зонд будет откалибрирован до эксперимента, все сигналы упомянутые выше будут сразу количествены. Эту тарировку можно сделать следующим образом:

  1. Включите жесткую часть образца (как стекло) и запишите кривый усилия от которой чувствительность по отклонению можно высчитать.
  2. Разделите и высчитайте весну постоянн используя «Термальную Настройку».
  3. Запишите изображение топографии образца Tipcheck для того чтобы получить значение R. радиуса подсказки.
  4. После вводить оцененное значение R, деформация отрегулирована на образце выбора. Образец, котор нужно просмотреть должен иметь подобные механически свойства как биологический образец который будет расследован во время эксперимента.

На большом части из испытанных образцов, пригонка Sneddon была использована для того чтобы извлечь Young модуль путем захватывать архив HSDC (Высокоскоростного Сбора Данных) на линии развертки на очень высоком разрешении. Когда профили усилия и высоты сравнены, non-пожеланные части (кривые усилия захватили на части образца который нет интереса, как стекло) можно исключить вручную. Кривые остального усилия можно ехпортировать как одиночный архив, столб-обрабатываемый внешней программой, и средний Young модуль может быть высчитан путем рассмотрение различных теорий контакта, как модель Sneddon.

Эта механически теория рассматривает контакт между эластичным полупространством деформированным твердым коническим индентером (диаграммой 2b), определяя что нагрузка пропорциональна к квадрату глубины проникания. Глубина вмятия и радиус подсказки отнесены мимо:

Диаграмма 2. механики Контакта в AFM. В a, пригонка DMT основана на Hertzian предположении но заявляет что усилия прилипания сфокусированы вне площади контакта. Это хорошо приспособлено к high-density полимерам и бедно deformable образцам. В b, пригонка Sneddon рассматривает подсказку как инфинитный конический индентер, который хорошо приспособлен к мягким (биологическо) и deformable образцам.

На таких образцах, был испытан широкий диапазон зондов AFM и рекомендация уступана диаграмма 3. Самые мягкие существуя зонды на рынке OBL-B, которые имеют номинальную константу весны 0,006 N/m и таким образом соотвествующие для того чтобы расследовать супер мягкие живущие клетки, как невроны.

Диаграмма 3. Ряд соответствия различных биологических образцов и соответствуя зондов AFM порекомендованных для Пиковый Выстукивать Усилия. В зависимости от их типа, eukaryotic клетки могут показать очень различные механически свойства. Невроны могут быть весьма мягки (вниз к 1kPa) тогда как клетка косточки может быть как робастна как бактерии. Правильно для того чтобы зондировать свойства клетки, выбирающ правую весну постоянн и таким образом чувствительность необходима.

Образцы Воображения Биологические с PeakForce QNM

Морские биологические образцы часто составлены смеси мягких и твердых компонентов. Образец воды принятый от Адриатического Моря был положен на стеклянную вставку и был расследован PeakForce QNM. За исключением очень уместных замечаний на живущих диатомеях, некоторые обмылки клеточной оболочки также были найдены в подвесе. Диаграмма 4 дает пример как те структуры смотрят. Профиль 3D-topography показывает характеристику waffle-как структура с порами 100 nm в размере и средней высоте 20 nm. Канал прилипания показывает маркированный контраст между дном пор (около 50 pN в среднем) и остальноями клеточной оболочки (более менее чем 20 pN). Однако, самые информативные каналы упругость и данные по деформации. На обоих каналах 3 части frustule выдающийся, каждое показывая ясно различные механически свойства: центр поры (среднего Young модуля kPa ~300 и средней деформации ~7 nm), кольцо вокруг поры (~75 kPa и ~25 nm) и часть сердечника клеточной оболочки, которая кажется, что имеет промежуточные механически свойства (~200 kPa и ~10 nm).

Диаграмма 4. Воображение клеточной оболочки фитопланктона с Катализатором AFM BioScope. Верхнее левое: изображение диатомеи, учтивость электронной микроскопии образца Дэнниса Kunkel, Astrographics. Большой Часть из каналов PeakForce QNM обеспечивает замечательный контраст и характеристики высок-разрешения.

Дополнительные эксперименты были унесены на бактериях Escherichia Coli K12. Не Похож На большой часть из видов Escherichia Coli, напряжения K12 могл умножить в кишечнике и в частности упорны к антителам. Одна из их других характеристик что они обладают pili (см. диаграмму 5a) что типично вытяните под условиями расхода или любой усиливая окружающей средой. До теперь, воображение те бактерии живые с AFM, в любом режиме, не будет значительная возможность и исторически неуловимый результат.

На Диаграмму 5 показано легко полученные изображения высок-разрешения таких живущих бактерий, в меньш чем одном часе. Как можно видеть на 3D-representation канала высоты (диаграммы 5b), pili больше не видимо, которое может быть объяснено фактом что извлекающ от их средства подвеса и распространяющ их на тарелке наводит усилие которое причиняет тем pili вытянуть. На Диаграмму 5c показано канал модуля DMT. Путем использование пригонки Sneddon, был определены, что был средний Young модуль kPa 183, которое совершенно соответствует предыдущим замечаниям.

Диаграмма 5. бактерии Escherichia Coli K12 imaged PeakForce QNM на Катализаторе AFM BioScope. В a, нарисована структура напряжения. В b, показано представление 3D-height AFM 10x10μm группы бактерий. В c, Young канал модуля (z-маштаб: 0-4GPa) показано. Это the first time что такие бактерии imaged живые AFM.

Динамика Клетки Контроля в Реальное Временя

Все живущие клетки динамическая, изменяя форма должная к перераспределению их ремонтины цитоскелета и распространять и проникать на субстрате культуры клетки. Эти процессы и механически изменения которые сопровождают их можно контролировать используя PeakForce QNM. В другом комплекте экспериментов, PeakForce QNM было использовано для того чтобы расследовать клетки glioblastoma. Glioblastoma значительно самой общей и самой злокачественной формой рака мозга. Живущие клетки glioblastoma imaged PeakForce QNM на Катализаторе BioScope и поддерживаемым живым на время эксперимента при помощи PSI. Эта технология позволяет пользователю приложить очень нежное к вмеру усилию на образце, в зависимости от необходима информации. Придавая очень светлое усилие на образце, topmost характеристики клетки (glycocalyx, выступаний) можно зондировать. С другой стороны, необходимо, что воспринимает немножко более высокое усилие органелл и цитоскелета расположенных под мембраной плазмы. Зондировать реальные механически свойства образца также требует вмятия образца (и таким образом изогните в cantilever) хотя бы 100 nm. Вычисляйте что выставки 6a типичное изображение высок-разрешения получило на живущем glioblastoma пока придающ вмеру усилие (~300 pN).

Диаграмма 6. Изображения живущих клеток glioblastoma PeakForce QNM и Катализатором AFM BioScope. В a, изображение высоты 40x40μm записанное на вмеру усилии показывает и topmost и внутренние структуры. В b, показан верхний слой 3D 15x15μm каналов топографии и деформации. Катализатор BioScope Bruker с Перфузировать Инкубатор Этапа предлагает самый лучший баланс воображения живущей клетки для долгосрочных экспериментов.

Keratinocytes главные компоненты outermost слоя людской кожи. Изучающ такие клетки исследователями помощи AFM поймите процесс рака кожи или других ухудшений.

HaCat бессмертная линия клетки людских keratinocytes которая широко расследована в цитологии и также представляет хороший выбранный для того чтобы исследовать потенциал PeakForce QNM. Клетки подверглись действию к оксидативному агенту способному наводить усилие. В ответ на это химическое агрессию, клетки клонат преобразовать и синтезировать так называемые волокна усилия актина. Типичное средств изображение разрешения показано в диаграмме 7.

Диаграмма 7. изображение Катализатора и PeakForce QNM BioScope 75x75μm живя клеток HaCat под оксидативным усилием. Клетки реагируют быстро синтезировать волоконца усилия для того чтобы установить контакты с смежными клетками. Такие динамические процессы могут также быть отслежены путем использование этого метода.

В PeakForce QNM, кривый усилия сделана для каждого пиксела изображения, таким образом разрешение это же на всех каналах. Этот пример иллюстрирует как легко и голодает (изображения разрешения пиксела 384x384 можно захватить в 6 до 9 минутах) оно к сразу и в количественном образе зонд изменяет в топографии и механически свойствах живущих клеток в ответ на обработки снадобья.

Overlaying AFM и Оптически Каналы

Другая из настоящих ключевых возможностей для биологических применений мочь получить данные по оптически и AFM одновременно. Характеристику Зарегистрирования и Верхнего Слоя Изображения Микроскопа Bruker исключительную (MIRO™) можно использовать легко для того чтобы импортировать изображения оптически/флуоресцирования в ПО NanoScope® и overlay их с изображениями AFM. После короткой тарировки, пользователь может выбрать положение для того чтобы сделать AFM просмотреть. Таким Образом образец автоматически можно двинуть к пожеланному положению и изображение AFM может быть захваченным пикселом пикселом, и полно интегрировано в оптически изображение.

На Диаграмму 8 показано верхний слой достиганный на живя эндотелиальных клетках. Изображение флуоресцирования (двойн-пятнающ DAPI для ядра и á-phalloidin для нитей актина) установлено как предпосылка и перекрыно при изображение AFM сделанное смешивания 2 каналов: пиковая ошибка усилия и Young модуль. Транспарант был установлен на 50% так, что сразу корреляцию можно сделать между различными частями клеток (видимых топографией и флуоресцированием AFM) и их соответствуя механически свойствами (Young каналом AFM модуля). В b, представлены c и d индивидуальная пиковая ошибка усилия, Young модуль и изображения AFM деформации. Его можно ясно увидеть в упругости и каналы деформации которые на краях клеток где толщина слишком низка, влияние ремонтины (стекла) на механически свойствах образца non незначительны, тогда как на части сердечника клеток, средний Young модуль очень более надежн (kPa 45,3). Для дела ясности, только 3 канала AFM показаны здесь, но 8 различных сигналов можно показать одновременно.

Диаграмма 8. Верхний Слой флуоресцирования и изображения AFM живя клеток HUVEC созданных с MIRO на Катализаторе BioScope. Главным образом преимущество MIRO включить дисплей данных по оптически и AFM одновременно. Работая с functionalized зондами, «вариант Пункта & Всхода» можно также использовать точно для того чтобы вызвать измерение усилия на пожеланных положениях без терять лиганд.

Заключение

Применения показанные выше демонстрируют что Выстукивать Усилия Пика значительно самым мощным и сегодня количественного метода AFM высок-разрешения доступное для того чтобы зондировать количественный химикат и механически свойства живя биологических образцов с приемом быстро проходит соответствующее к TappingMode. Число различных механически свойств которые можно характеризовать превышает то из других обыкновенно используемых режимов AFM. Свой потенциал вымощает путь для много exciting новых применений в поле биологии, специально в онкологическом исследовании и сердечнососудистых заболеваниях.

О Bruker

Поверхности Bruker Nano обеспечивают Атомные продукты Микроскопа Усилия/Микроскопа Зонда Скеннирования (AFM/SPM) которые стоят вне от других имеющих на рынке систем для их робастных конструкции и легкия в использовании, пока поддерживающ самое высокое разрешение. Головка NANOS измеряя, которая часть всех наших аппаратур, использует уникально волоконнооптический интерферометр для измерять консольное отклонение, которое делает компакт настроения так что оно не большле чем стандартная задача микроскопа исследования.

Эта информация найденный, расмотрена и приспособлена от материалов обеспеченных Поверхностями Bruker Nano.

Для больше информации на этом источнике, пожалуйста посетите Поверхности Bruker Nano.

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:27

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit