Atom- StyrkaMicroscopy: Kvantitativt Avbilda av att Bo som är Biologiskt, Tar Prov genom att använda PeakForce QNM

Vid AZoNano

Bordlägga av Tillfredsställer

Inledning
AFM- och CellMekaniker
Quantification Lätt Med Hög Upplösning av Tar Prov Mekanisk Rekvisita
Rikta Quantification av AFM Signalerar på Biologiskt Tar Prov
att Avbilda som är Biologiskt, Tar Prov med PeakForce QNM
ÖvervakningCellDynamik i Real-time
Överdra AFM och Optiskt Kanaliserar
Avslutning
Om Bruker

Inledning

Det är ett välkänt faktum att när du bestämmer den mekaniska rekvisitan av att bo cellföre detta vivo kan indikera organismen som är vård- från vilket de drogs ut. Bestämt i styrkafunktionsläget, är AFM ett kraftigt diagnostiskt, och investigational bearbeta. Styrkaspektroskopin har en radda missgynnar liksom mindre upplösning, rusar av förvärv, och den ger inte den nödvändiga kvantitativa informationen. PeakForce QNM har framkallats av Bruker för att erbjuda informativa data på kickupplösning med anmärkningsvärt lindrar - av - bruk.

AFM- och CellMekaniker

Efter dess utveckling är AFM en bearbeta av primat som avbildar toppet mjukt biologiskt, tar prov, speciellt med uppkomsten av TappingMode™, och styrkaspektroskopin och faktumet, att det är, en av de få microscopyteknikerna, som låter, observationen av celler under near-fysiologiskt villkorar. AFM är ofta van vid korrelatresåruppförande och cellflyttning eller uppdelning. Stora majoriteten av dessa studier baseras på TappingMode, buktar singel-styrka, eller styrka-volym mätningar.

TappingMode erbjuder fördelen av att applicera försumbara nominal-, friktions- och saxstyrkor och arrangerar gradvis att avbilda reflekterar energin som skingras mellan spetsen och ta prov under varje klapp på ytbehandla. Styrkavolym är en annan kraftig teknik som baseras på styrkamätningar som uppnås på en matris av, pekar definierat av användaren. Styvhet och adhesionen mellan spetsen och ta prov kan dras ut från varje styrka buktar. I fall att functionalizeds spetsen med en molekyl av intresserar, specifika unbinding händelser kan också identifieras på tillbakadragningen buktar. Till betaget har dessa flaskhalsar, Bruker framkallat PeakForce QNM.

Quantification Lätt Med Hög Upplösning av Tar Prov Mekanisk Rekvisita

PeakForce QNM möjliggör riktar extraktion av kvantitativ nanomechanical information från biologiskt tar prov, utan att skada ta prov. Den har baserat på Peak Knackande Lätt På teknologi för Styrka, som sonden svängs under i ett liknande danar, som den är i TappingMode, men på avlägset nedanfört resonansfrekvensen (1 eller 2 kHz beroende av bearbeta). Varje gång spetsen och ta prov kommas med tillsammans, buktar en styrka fångas. Emellertid var återkopplingen kretsar, underhåller den knackande lätt på amplitudkonstanten i TappingMode, Maximal StyrkaKnackning kontrollerar maximat maximal styrka på sonden. Dessa styrkor kan kontrolleras på jämnar mycket lägre än kontaktfunktionsläge och fäller ned även, än TappingMode som låter funktion på även det mest delikat biologiskt, tar prov.

Figurera shows 1 som den olika styrkan sätter in erfarit av sonden under entillbakadragning cyklar, såväl som alla information, som kan dras ut från den frambragda styrkan, buktar. (Figurera 1a), När sonden att närma sig ta prov, har den dragit besegrar in mot ytbehandla av dragningskraftar, som är främst capillaryen, Skåpbil der Waals och elektrostatiska styrkor. På peka B, blir de negationstyrkor higher än cantilever'sens styvhet, som orsakar spetsen till handtag till ytbehandla och startar därefter inryckning in i ta prov, tills Z-Placera av moduleringen ner dess maximum (peka C). Detta placerar föreställer maximat som maximal styrka värderar, som används för återkopplingen kontrollerar. Efter detta har pekat, startar sonden att återta, tills den ner handtag-av pekar (maximat adhesion pekar, som motsvarar också till den minimum styrkan). Därefter fortsätter spetsen tillbakadragning, och räckvidder till dess original placerar tillbaka (E) var (som i A) ingen mer styrka sätter in dess affekter vinkar.

Figurera 1. Funktionsduglig princip av PeakForce QNM. Fördriva sonden svängs, en styrka buktar antecknas för varje PIXEL av avbilda. Att skilja mellan det olikt portionr av spetstrajectoryen, antecknades detta exempel, genom att använda en TAP150A-sond, som är typisk van vid avbildar det snarlika lik, och dåligt eftergivent tar prov. På biologiskt tar prov, den typiska maximala styrkan kan vara upp till tusen tider lower.

Detta modellerar mekaniker antar, att kontaktprincipen återstår samma, som i det Hertzian modellera, men betraktar extra attraktiva växelverkan fokuserad insida som en annulus lokaliserade förutom kontaktområdet (figurera 2a). Isåfall, och betrakta kontakten mellan en sphere och ett resårhalva-utrymme, förbinds styrkan till deformeringen by:

var E* föreställer den förminskande Young modulusen, Ret spetsradien och Det deformeringdjupet.

Slutligen, erhålls energin som skingras av spetsen och ta prov under varje klapp på ytbehandla, genom att integrera området mellan att närma sig och tillbakadragningen buktar.

Rikta Quantification av AFM Signalerar på Biologiskt Tar Prov

Att över ska var direkt kvantitativ, När sonden kalibreras före experiment som är alla signalerar nämnt. Denna kalibrering kan göras som följer:

  1. Koppla In en styv del av ta prov (likt exponeringsglas) och anteckna en styrka buktar från vilket avböjningskänsligheten kan beräknas.
  2. Återta och beräkna fjädrakonstanten som använder ”Thermalen, Trimmar”.
  3. Anteckna en topografi avbildar av Tipchecken tar prov för att erhålla en värdera av spetsradien R.
  4. Når du har skrivit in det beräknade Ret, värdera, deformeringen justeras på en ta prov av primat. Ta prov som ska avläs bör ha liknande mekanisk rekvisita som det biologiskt att ta prov att ska utforskas under experiment.

På mest av testad tar prov, en Sneddon passform var det van vid extraktet som den Young modulusen, genom att fånga en HSDC (Snabbt DataTillfångatagande) sparar på en bildläsning fodrar på mycket en kickupplösning. När styrkan och höjden profilerar, jämförs, deönskade delarna (styrka buktar fångat på en portion av ta prov som inte är av intresserar, liksom exponeringsglas), kan vara uteslutet manuellt. Den resterande styrkan buktar kan exporteras som en gåsmarsch som posta-bearbetas av ett yttre program, och den genomsnittliga Young modulusen kan beräknas, genom att betrakta olika kontaktteorier, liksom Sneddonen, modellerar.

Denna mekaniska teori betraktar kontakten mellan ett resårhalva-utrymme deformerat av en styv konisk indenter (figurera 2b) som bestämmer att ladda är proportionell till kvadrera av genomträngningsdjupet. Inryckningsdjupet och spetsradien förbinds by:

Figurera 2. Kontakta mekaniker i AFM. I a baseras påstår DMT-passformen på ett Hertzian antagande men att adhesionstyrkorna fokuseras utanför kontaktområdet. Detta anpassas väl till kick-täthet polymrer, och dåligt deformable tar prov. I b betraktar den Sneddon passformen spetsen som en oändlig konisk indenter, som anpassas väl till mjukt (biologiskt), och deformable tar prov.

På sådan tar prov, har en lång räcka av AFM-sonder testats, och rekommendationen ges in figurerar 3. De mest mjuka existerande sonderna på marknadsföra är OBL-B, som har en nominal att fjädra konstant av 0,006 N/m och är anslår thus för att utforska toppna mjuka bosatt celler, liksom neurons.

Figurera 3. Spänna av överensstämmelse av olikt biologiskt tar prov, och motsvarande AFM-sonder som rekommenderas för Peak, Tvingar Knackning. Beroende av deras typ kan eukaryotic celler ställa ut mycket olik mekanisk rekvisita. Neurons kan vara extremt mjuka (besegra till 1kPa), eftersom bencellen kan vara så robustt som bakterier. För att riktigt sondera cellrekvisitan som väljer rätten, fjädra konstanten, och thus är känsligheten ombud.

att Avbilda som är Biologiskt, Tar Prov med PeakForce QNM

Marin- biologiskt tar prov komponeras ofta av en blandning av mjuka och styva delar. En ta prov av bevattnar taget från det Adriatic Havet var pålagd en glass glidbana och utforskat av PeakForce QNM. Annat än mycket relevant observationer på bosatt diatoms, några cellväggkvarlevor fanns också i upphängningen. Figurera 4 ger ett exempel hur de strukturerar look. 3Dna-topography profilerar avslöjer en karakteristisk dillande-något liknande strukturerar med por 100 som nm storleksanpassar in och en medellängd av 20 nm. Adhesionen kanaliserar shows en markerad kontrast mellan bottnen av porna (omkring 50 pN i genomsnitt) och vila av cellväggen (mindre än 20 pN). Emellertid kanaliserar det mest informativ är spänsten och deformeringdatan. På båda kanaliserar trena portionr av frustulen är distingerat, varje som ställer ut klart olik mekanisk rekvisita: centrera av por (genomsnittlig Young modulus av deformering för kPa ~300 och genomsnittav ~7 nm), ringa runt om por (~75 kPa och ~25 nm) och kärna urdelen av cellväggen, som verkar för att ha mellanliggande mekanisk rekvisita (~200 kPa och ~10 nm).

Figurera 4. Avbilda av phytoplanktoncellväggen med en BioScopeKatalysator AFM. Top lämnade: elektronmicroscopy avbildar av en diatom, tar prov artighet av Dennis Kunkel, Astrographics. Mest av PeakForcen QNM kanaliserar ger en anmärkningsvärd kontrast och särdrag med hög upplösning.

Extra experiment bars ut på Escherichia Coli K12 bakterier. I Motsats Till mest av Escherichia Coli art anstränger K12 är kompetent att multiplicera i inälvan och är bestämt resistent till antikroppar. Ett av deras andra kännetecken är att de äger pili (se för att figurera 5a) att dra tillbaka typisk under uttömmning villkorar eller någon belastande miljö. Till nu har att avbilda de bakterier som är vid liv med AFMEN, i något funktionsläge, varit en betydlig utmaning och ett historically gäcka resultat.

Figurera 5 shows som är med hög upplösning, avbildar av sådan bosatt bakterier, lätt erhållande i mer mindre än en timme. Som synes på 3Den-representation av höjden kanalisera (figurera 5b), pilien är ej längre synligt, som kan förklaras av faktumet att dra ut från deras upphängningmedel och fördela dem på en maträtt framkallar en spänning som orsakar de pili för att dra tillbaka. Figurera shows 5c som DMT-modulusen kanaliserar. Genom att använda en Sneddon passform, var den genomsnittliga Young modulusen beslutsam att vara kPa 183, som matchar perfekt föregående observationer.

Figurera 5. Escherichia Coli K12 bakterier avbildade vid PeakForce QNM på en BioScopeKatalysator AFM. I a dras strukturera av anstränga. I b visas en framställning 3D-height för AFM 10x10μm av en samla i en klunga av bakterier. I c kanaliserar den Young modulusen (z-fjäll: 0-4GPa) visas. Denna är den första tiden att sådan bakterier har varit avbildat vid liv av AFM.

ÖvervakningCellDynamik i Real-time

Alla bosatt celler är dynamiska och att ändra forma tack vare rearrangementen av deras cytoskeletonscaffold och fördelning och migrating på cellkultursubstraten. Dessa bearbetar, och de mekaniska ändringarna, som medföljer dem, kan övervakas genom att använda PeakForcen QNM. I en annan uppsättning av experiment var PeakForce QNM van vid utforskar glioblastomaceller. Glioblastoma är vid långt den mest allmänningen, och elakartat bilda av hjärncancer. Bosatt glioblastomaceller har avbildats av PeakForce QNM på BioScopeKatalysatorn och underhållet vid liv för tiden av experiment vid bruket av PSI. Denna teknologi låter användaren applicera mycket en stilla för att dämpa styrka på ta prov, beroende av den behövda informationen. När du applicerar en mycket ljus styrka på ta prov, kan de översta särdragen av cellen (glycocalyx, framstickanden) sonderas. Å andra sidan krävs en litet högre styrka för att avkänna organellesna och cytoskeletonen som lokaliseras under plasmamembranet. När du Sonderar den verkliga mekaniska rekvisitan av ta prov kräver också inryckningen av ta prov (och böja thus i cantileveren), vid åtminstone hundra nm. Figurera shows 6a som ett typisk med hög upplösning avbildar erhållande på bosatt glioblastomastunder som applicerar en dämpastyrka (~300 pN).

Figurera 6. Avbildar av bosatt glioblastomaceller vid PeakForce QNM och BioScopeKatalysatorn AFM. I a avbildar 40x40μm höjd antecknat på översta shows för en dämpastyrka både, och inre strukturerar. I b överdrar 15x15μm 3D av topografi, och deformering kanaliserar visas. Brukers BioScopeKatalysatorn med Perfusing Arrangerar Kuvöserbjudanden som det bäst balanserar av den bosatt cellen som avbildar för långsiktiga experiment.

Keratinocytes är ha som huvudämnedelarna av det yttersta lagrar av människan flår. Studera sådan celler av AFM-hjälpforskare förstå att det processaa av flår cancer eller andra försämringar.

HaCat är en odödlig cell fodrar av människakeratinocytes som utforskas brett i cytology och föreställer också en bra kandidat för att undersöka det potentiellt av PeakForce QNM. Cellerna var utsatta till ett oxidative medel som var kapabelt av framkallande av en spänning. Som svar på denna kemiska agression ansar cellerna för att omforma och synthesize så-kallade actinspänningsfibrer. En typisk medelupplösning avbildar visas in figurerar 7.

Figurera den 7. 75x75μm BioScopeKatalysatorn, och PeakForce QNM avbildar av att bo HaCat celler under oxidative spänning. Cellerna reagerar, vid synthesizing snabbt av spänningsfibrils för att upprätta kontakter med närgränsande celler. Sådan dynamiskt bearbetar kan också spåras, genom att använda denna teknik.

I PeakForce QNM, buktar en styrka göras för varje PIXEL av avbilda, således är upplösningen samma på alla kanaliserar. Detta exempel illustrerar, hur lätt och fastar (upplösning för PIXELet 384x384 avbildar kan fångas i 6 till 9 noterar), den är till direkt, och i kvantitativt sätt ändrar en sond i topografi och mekanisk rekvisita av att bo celler som svar på drogbehandlingar.

Överdra AFM och Optiskt Kanaliserar

Another av de nyckel- utmaningarna för strömmen för biologiska applikationer är att vara kompetent att få optisk och om AFM information samtidigt. Brukers artikel med ensamrättMikroskopet Avbildar Registrering och Överdrar särdrag (MIRO™) kan vara den optiska/fluorescence van vid lätt importen avbildar in i NanoScope® programvara och överdrar dem med AFM avbildar. Efter en kort kalibrering, användaren har kunnat välja läget för att göra AFMEN att avläsa. Således kan ta prov automatiskt vara rörd till önskad placerar, och AFMEN avbildar kan vara det fångade PIXELet vid PIXELet, och fullständigt integrerat in i det optiskt avbilda.

Figurera 8 shows som en överdra uppnådde på att bo endothelial celler. Fluorescencen avbildar (dubblett-befläcka DAPI för nucleus och á-phalloidin för actinglödtrådar) är fastställd som bakgrunden, och överlappat med en AFM avbilda gjort av en blandning av två kanaliserar: nå en höjdpunkt styrkafelet och den Young modulusen. Stordian var fastställd på 50%, så att en riktakorrelation kan göras mellan de olika delarna av cellerna (som är synliga vid AFM-topografi och fluorescence) och deras motsvarande mekaniska rekvisita (den Young modulusen AFM kanaliserar). I b avbildar c och D det maximala styrkafelet för individen, den Young modulusen och deformering AFM föreställs. Det kan klart ses i spänsten, och deformering kanaliserar det på kantar av celler, var tjockleken är för låg, påverkan av scaffolden (exponeringsglas) på den mekaniska rekvisitan av ta prov är non försumbar, eftersom på kärna urdelen av cellerna, den genomsnittliga Young modulusen är mycket pålitligare (kPa 45,3). För en materia av klarhet visas endast tre som AFM kanaliserar, här, men olika åtta signalerar kan visas samtidigt.

Figurera 8. Överdra av fluorescence, och AFM avbildar av att bo HUVEC-celler som skapas med MIRO på en BioScopeKatalysator. Det huvudsakligt gynnar av MIRO är att möjliggöra skärmen av optisk och om AFM information samtidigt. När du fungerar med functionalized sonder, ”Peka, & kan ett For” alternativ också vara van vid startar exakt styrkamätning på önskade lägen, utan att förlora liganden.

Avslutning

Applikationerna som över visas visar att Maximal StyrkaKnackning är vid långt det kraftigast och den tillgängliga todayen för den kvantitativa AFM-tekniken med hög upplösning som sonderar biologisk kvantitativ kemisk och mekanisk rekvisita av att bo tar prov med ett förvärv rusar jämförbart till TappingMode. Numrera av olik mekanisk rekvisita, som kan karakteriseras, överskrider det av andra gemensamt använda AFM-funktionslägen. Dess potentiellt stenlägger långt för många spännande nya applikationer i sätta in av biologi, speciellt i cancerforskning och kardiovaskulära sjukdomar.

Om Bruker

Nano Bruker Ytbehandlar ger Atom- produkter för det StyrkaMikroskop-/ScanningSondMikroskopet (AFM/SPM), som står ut från annan kommersiellt - tillgängliga system för deras robustt design och lindra-av-bruk, stunden som underhåller den högsta upplösningen. NANOSEN som mäter huvudet, som är den vår delen allra, instrumenterar, använder en unik fiber-optisk interferometer för att mäta cantileveravböjningen, som gör överenskommelsen för ställa in så, att den är inte större än ett standart forskningmikroskopmål.

Denna information har varit sourced, granskat, och anpassat från material förutsatt att av Nano Bruker Ytbehandlar.

Behaga besök Nano Bruker Ytbehandlar För mer information på denna källa.

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:31

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit