基本強制顯微學: 居住的生物範例定量想像使用 PeakForce QNM 的

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目錄

簡介
AFM 和細胞機械工
範例機械性能的容易,高分辨率量化
AFM 信號的直接量化在生物範例的
與 PeakForce QNM 的想像生物範例
監控細胞動力在實時
覆蓋的 AFM 和光學通道
結論
關於 Bruker

簡介

它是一個著名的情況確定活細胞前體內機械性能可能指示他們被提取的有機體的健康。 特別地在強制模式, AFM 是一個強大的診斷和調查工具。 強制分光學有很多缺點例如較少解決方法,購買的速度,并且它不提供需要的定量信息。 PeakForce QNMBruker 開發提供情報數據在與卓越的易用的高分辨率。

AFM 和細胞機械工

從其發展, AFM 是選擇工具對圖像超級軟的生物範例,特別是與 TappingMode™和強制分光學和這個情況誕生它是在近生理情況下允許細胞觀察少數個顯微學技術的之一。 AFM 是常用的關聯有彈性工作情況和細胞遷移或者部門。 绝大多數這些研究在 TappingMode、單一強制曲線或者強制數量評定基礎上。

TappingMode 提供 應用 微不足道 的 名詞性 的 詞 、 摩擦 和 剪切力 的 好處 , , 并且 階段 想像 反射 這 個 能源 被消散 在 這 個 技巧 和 這 個 範例 之間 在 在 表面 的 每 輕拍 期間 。 強制數量是在強制評定基礎上的另一個強大的技術達到在這個用戶定義的點矩陣。 僵硬和黏附力在這個技巧和這個範例之間可以從每強制曲線被提取。 萬一這個技巧 functionalized 與分子利益,特定斷開的活動在收縮曲線可能也被識別。 要解決這些瓶頸, Bruker 開發 PeakForce QNM

範例機械性能的容易,高分辨率量化

PeakForce QNM 啟用定量 nanomechanical 信息的直接提取從生物範例的,无需損壞這個範例。 它有根據高峰強制開發的技術,在期間探測相似地擺動,當它在 TappingMode,但是在遠低於共鳴頻率 (1 或 2 kHz 根據工具)。 每次這個技巧和這個範例被帶來,強制曲線被獲取。 然而,其中反饋環路維護這個開發的高度恆定在 TappingMode,高峰強制開發的控制在探測的最大高峰強制。 這些強制低於聯繫模式可以是受控的在級別和甚而低於 TappingMode 允許在甚而最精美的生物範例的運算。

圖 1 顯示探測體驗的不同的力場在途徑縮回循環,以及可以從被生成的強制被提取彎曲的所有信息時。 當探測處理這個範例 (圖 1a) 時,它拉下往表面由吸引力,主要血絲,範 der Waals 和靜電力。 在點 B,那些負強制高於懸臂的僵硬成為,造成這個技巧拉到表面然後開始縮進到這個範例,直到模塊化的 Z 位置到達其最大數量 (點 C)。 此位置表示最大高峰強制值,為反饋控制使用。 在此點以後,探測開始讓步,直到它到達駛離點 (最大黏附力點,也對應於最小的強制)。 然後這個技巧持續縮回并且到達回到其原始位置 (e) (在 A) 沒有其他力場不影響其行動。

圖 1. PeakForce QNM 工作原理。 當探測擺動時,強制曲線為這個圖像的每像素被記錄。 通過使用 TAP150A 探測,要區分技巧彈道之間的區別部分,此示例被記錄,典型地使用對相當僵硬的圖像和惡劣兼容範例。 在生物範例,典型的高峰強制可以至一千次更低。

此機械工設計假設,聯絡原則在這個赫茲波的設計依然是同一樣,但是考慮另外的有吸引力的交往集中在環體裡面位於在聯繫範圍 (圖 2a) 外面。 在該案件和就在範圍和有彈性半空格之間的聯絡而論,強制與變形有關:

那裡 E* 表示這个減少的年輕的模數、 R 技巧半徑和 d 變形深度。

最終,這個技巧消散的這個能源和這個範例在表面的每輕拍期間通過集成在這個途徑和收縮曲線之間的區得到。

AFM 信號的直接量化在生物範例的

當探測在這個實驗之前被校準,以上提到的所有信號將直接地是定量的。 此定標可以完成如下:

  1. 從事這個範例的一個僵硬的部分 (像玻璃) 并且記錄偏轉靈敏度可以被計算的強制曲線。
  2. 提取并且計算彈簧恆定使用 「熱量聲調」。
  3. 記錄 Tipcheck 範例的地勢圖像得到技巧半徑 R. 的值。
  4. 在輸入估計的 R 值以後,變形在選擇範例被調整。 將瀏覽的這個範例應該有相似的機械性能作為在這個實驗期間,將調查的生物範例。

在大多被測試的範例,獲取在掃描線的一個 HSDC (高速數據捕獲) 文件用於 Sneddon 適應提取這個年輕的模數在非常高分辨率。 當強制和高度配置文件被比較時,非希望的零件 (強制曲線在不是利益範例的部分獲取了,例如玻璃) 可以手動地被排除。 殘存部隊曲線可以被導出作為一個單一文件,後加工由外部程序,并且平均年輕的模數可以通過考慮不同的聯絡原理計算,例如 Sneddon 設計。

此機械原理考慮在嚴格的圓錐形受託代購商扭屈的有彈性半空格之間的聯絡 (圖 2b),確定負荷與有效膚深的正方形是按比例。 凹進深度和技巧半徑涉及:

圖 2. AFM 的聯絡機械工。 在 a, DMT 適應根據赫茲波的假設,但是闡明,黏附力強制在聯繫範圍之外集中。 這很好適應高密度聚合物和惡劣可變性的範例。 在 b, Sneddon 適應這個技巧把無限圓錐形受託代購商視為,很好適應軟 (生物) 和可變性的範例。

在這樣範例,各種各樣的 AFM 探測被測試了,并且這個推薦標準在表 3. 產生。 在這個市場上的最軟的現有的探測是 OBL-B,有 0.006 N/m 一個名義上的彈簧常數并且因而是適當調查超級軟的活細胞,例如神經元。

圖 3. 多種生物範例和對應的為高峰強制開發建議使用的 AFM 探測標準範圍。 根據他們的類型,真核狀態的細胞可能陳列非常不同的機械性能。 神經元可以非常軟 (下來對 1kPa),而骨細胞可以是一樣穩健的像細菌。 為了適當地探查細胞屬性,選擇恆定正確的彈簧和因而區分是必須的。

與 PeakForce QNM 的想像生物範例

海洋生物範例由軟和嚴格的要素混合物經常組成。 從亞得里亞海拿取的水範例在一個載玻片上把放并且由 PeakForce QNM 調查。 除非常在生存硅藻的相關觀察之外,一些細胞壁殘餘在暫掛也被找到。 圖 4 舉一個例子那些結構如何查找。 3D 地勢配置文件在大小上顯示與毛孔的一個典型像奶蛋烘餅的結構 100 毫微米和一個平均高度 20 毫微米。 黏附力通道顯示在毛孔 (大約 50 pN 的底層在平均數) 和細胞壁的其餘的之間一個明顯對比 (少於 20 pN)。 然而,最情報的通道是彈性和變形數據。 在兩條通道上 frustule 的三個部分是著名的,陳列明顯地不同的機械性能的其中每一: 毛孔 (~300 kPa 和平均變形的平均年輕的模數的中心 ~7 毫微米),在毛孔附近的環形 (~75 kPa 和 ~25 毫微米) 和細胞壁的核心零件,似乎有半成品機械性能 (~200 kPa 和 ~10 毫微米)。

圖 4. 浮游植物有電影放映機催化劑的 AFM 細胞壁想像。 最左上側: 硅藻的電子顯微鏡術圖像,丹尼斯 Kunkel, Astrographics 抽樣禮貌。 大多 PeakForce QNM 通道提供一個卓越的對比和高分辨率功能。

另外的實驗在大腸埃希氏菌 K12 細菌被執行了。 不同於大多數大腸埃希氏菌種類, K12 張力能倍增在肚腑并且對抗體是特別有抵抗性。 他們的一個其他特性是他們擁有 pili (參見圖 5a) 请典型地縮回在取盡情況或所有強調的環境下。 直到現在,想像那些細菌運行與 AFM,在所有模式下,是一個嚴重的挑戰和一個歷史上逃避結果。

圖 5 在少於一時數顯示的這樣生存細菌,容易地得到的高分辨率圖像。 在高度通道 (圖 5b) 的 3D 表示能被看見, pili 不再是可視的,可以用這個情況解釋提取從他們的暫掛媒體和分佈他們在盤導致造成那些 pili 縮回的重點。 圖 5c 顯示 DMT 模數通道。 通過使用 Sneddon 適應,確定平均年輕的模數是 183 kPa,完全符合早先觀察。

在電影放映機催化劑 AFM 的圖 5. 大腸埃希氏菌 K12 細菌印象 PeakForce QNM。 在 a,畫張力的結構。 在 b,細菌字符串的 AFM 10x10μm 3D 高度表示顯示。 用 c,年輕的模數通道 (z 縮放比例: 0-4GPa) 表示。 這第一次是這樣細菌印象運行由 AFM。

監控細胞動力在實時

所有活細胞是動態,改變形狀由於他們的細胞骨架絞刑臺的重新整理和分佈和移居在細胞培養基體。 隨附於他們使用 PeakForce QNM的這些進程和機械更改可以被監控。 在另一條實驗裝置, PeakForce QNM 用於調查 glioblastoma 細胞。 Glioblastoma 顯然是腦癌的最公用和最惡性的表單。 生存 glioblastoma 細胞由在電影放映機催化劑的 PeakForce QNM 和被維護的運行是印象的在這個實驗的時期使用 PSI。 此技術允許這個用戶適用一非常柔和於在這個範例的中等強制,根據需要的信息。 當應用在這個範例時的非常輕的強制,這個細胞 (蛋白質複合物,伸進) 的最上面的功能可以被探查。 另一方面,要求輕微更強的強制感覺在質膜下和這個細胞骨架位於的細胞器。 探查這個範例的實際機械性能由一至少一百毫微米也要求這個範例的凹進 (和请因而屈曲在懸臂)。 圖 6a 一個典型的高分辨率圖像在生存 glioblastoma 獲得,當應用中等強制時的顯示 (~300 pN)。

圖 6. 生存 glioblastoma 細胞圖像 PeakForce QNM 和電影放映機催化劑 AFM。 在 a, 40x40μm 高度圖像被記錄在中等強制顯示最上面和內部結構。 在 b,地勢和變形通道 15x15μm 3D 重疊顯示。 Bruker 的與噴洒階段孵養器的電影放映機催化劑提供活細胞想像最佳的平衡長期實驗的。

Keratinocytes 是人力皮膚的最外層的層的主要元件。 學習這樣細胞由 AFM 幫助研究員瞭解皮膚癌或其他損傷的進程。

HaCat 是在細胞學方面廣泛調查並且表示一名好候選人測試 PeakForce QNM 潛在人力 keratinocytes 的不朽的細胞系。 細胞顯示了在一氧化作用者能够導致重點。 以回應此化工侵略,細胞傾向於變換和綜合所謂的肌動蛋白壓力纖維。 一個典型的媒體解決方法圖像在表 7. 顯示。

圖 7. 75x75μm 電影放映機居住的 HaCat 細胞的催化劑和 PeakForce QNM 圖像在氧化重點下的。 細胞通過迅速綜合重點原纖維設立與相鄰細胞的聯絡起反應。 通過使用此技術,這樣動態過程可能也被跟蹤。

PeakForce QNM,強制曲線為這個圖像的每像素做,因而這個解決方法在所有通道上相同。 此示例說明得多麼容易并且齋戒 (384x384 像素解決方法圖像可以在 6 到 9 分鐘之內被獲取) 它是對直接地,并且以一個定量方式探測在地勢和活細胞機械性能更改以回應藥物處理。

覆蓋的 AFM 和光學通道

別的生物應用的當前關鍵挑戰是能同時獲得光學和 AFM 信息。 Bruker 的獨有的顯微鏡圖像註冊和重疊 (MIRO™) 功能可以用於容易地導入光學/熒光圖像到 NanoScope® 軟件和躺在他們與 AFM 圖像。 在短的定標以後,這個用戶能選擇這個地點做 AFM 瀏覽。 因而這個範例可以自動地被移動向這個期望位置,并且 AFM 圖像可以是被獲取的像素由像素和充分地集成光學圖像。

圖 8 顯示在居住的內皮細胞的細胞達到的重疊。 熒光圖像 (二重弄髒中堅力量和 á-phalloidin 的 DAPI 肌動蛋白細絲的) 被設置作為這個背景并且與 AFM 圖像重疊做二條通道的混合: 高峰強制錯誤和年輕的模數。 這種透明度被設置了在 50%,以便正相關可以做細胞的區別部分 (可視由 AFM 地勢和熒光) 和他們對應的機械性能 (年輕的模數 AFM 通道) 之間。 在 b, c 和 d 單個高峰強制錯誤,年輕的模數和變形 AFM 圖像表示。 在彈性能明顯地被看見,并且在細胞邊緣這個厚度是太低的,這個絞刑臺的變形通道 (玻璃) 影響對這個範例機械性能是非微不足道的,而在細胞的核心零件,平均年輕的模數是可靠 (45.3 kPa)。 對於清晰問題,仅三條 AFM 通道顯示得這裡,但是八個不同信號可以同時被顯示。

圖 8. 熒光重疊和用 MIRO 創建的居住的 HUVEC 細胞的 AFM 圖像在電影放映機催化劑。 MIRO 的主要福利是同時啟用光學和 AFM 信息顯示。 當運行與 functionalized 探測時, 「點 & 射擊」選項可能也用於在期望地點準確地觸發強制評定,无需丟失這個配合基。

結論

顯示的應用以上顯示出,峰頂強制開發顯然是最強大的,并且定量高分辨率探查 AFM 技術可用的今天定量化學製品和居住的生物範例機械性能與購買的加速可比較與 TappingMode。 可以被分析不同的機械性能的數量超出那其他常用的 AFM 模式。 其潛在鋪平道路許多令人激動的新建應用程序的在生物領域,特別是在癌症研究和心血管疾病。

關於 Bruker

Bruker 納諾表面提供從他們的穩健設計和易用的其他商業可用的系統引人注意,維護最高分辨率的基本強制顯微鏡/掃描探測顯微鏡 (AFM/SPM) 產品。 NANOS 評定的題頭,是所有我們的儀器的一部分,使用評定的懸臂式偏折一臺唯一光導纖維的干涉儀,如此做設置協定它大於一個標準研究顯微鏡目的沒有。

此信息是來源,覆核和適應從 Bruker 納諾表面提供的材料。

關於此來源的更多信息,请請參觀 Bruker 納諾表面。

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:05

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