Biochemischer „Auf-Schalter“ Konnte Protein-Reinigungs-Herausforderung Lösen

Published on October 20, 2009 at 6:53 PM

Die Drogen, die auf ausgeführten Proteinen basieren, stellen eine neue Grenze für pharmazeutische Hersteller dar. Selbst nachdem sie ein Protein entdecken, das möglicherweise die Basis der folgenden Wunderdroge jedoch sie bildet, müssen ein althergebrachtes Problem konfrontieren: wie man große Mengen des Proteins in einem in hohem Grade reinen Zustand produziert. Jetzt hat ein multi-Institutionsforschungsteam möglicherweise einschließlich einen Biochemiker am National Institute of Standards and Technology (NIST) found* eine neue Lösung in einer enzymatischen „Küchenmaschine,“, das sie nach Belieben aufrufen können.

Die Hülle (im Grün oben), mit dem gewünschten Protein verband mit ihr (im Gelb am Recht), erstes festhält an dem ausgeführten Enzym (im blauen atbottom gelassen) - die weg gewaschen zu werden Verunreinigungen und andere Proteine erlaubend. Dann veranlaßt eine Infusion des Startens von Molekülen (rote Punkte) das Enzym, das gewünschte Protein weg zu schneiden (am Punkt, in dem die Hülle und das Protein anschließen), das in einem reinen Zustand montiert werden kann. Die Hülle kann dann weg gewaschen werden und der wiederholte worden Prozess. Kredit: NIST

Das Team hat eine effiziente Methode des Erntens von gereinigten Proteinmolekülen gefunden, indem es ein Enzym änderte, die Bakteriengebrauch beschmutzen, ihre Nahrung aufzugliedern. In seiner Wildform würde dieses Enzym von wenig Gebrauch, Entwickler Drogen beizumischen sein, aber das Team hat ihn geändert, damit er am gewünschten Moment aktiviert sein kann. Indem es im Wesentlichen einen „Aufschalter“ für die Enzymaktivität erstellte, hat das Team eine Methode gefunden, sich ein einzelnes, gewünschtes Protein von der Mischung von den Tausenden zu trennen, die durch eine lebende Zelle erzeugt werden, die natürliche Proteinfabrik der Biotechnologie der Wahl bleibt.

Bakterien verwenden das Enzym, genannt Subtilisin, als Sortierung der Küchenmaschine: Nachdem sie innerlich sie produziert haben, geben sie das Enzym in den Schmutz frei, in dem er eine winzige „Schaufel“ verwendet, um Proteine in verdauliche Stücke oben zu hacken. Weil er den Innenraum der Bakterie schädigen könnte, hat die Schaufel eine schützende Hülle, die nur weg einmal das Enzym hat verlassen die Zelle kommt.

„Das Enzym und die Hülle werden stark miteinander angezogen. Des Enzyms wirken zuerst ist, die Hülle weg zu schneiden,“ sagt Travis Gallagher NIST. „Die Methode nutzt ihre Anziehungskraft, um das Protein zu trennen, das wir wünschen.“

Das Team erstellt zuerst viele „sheathless“ Exemplare des Enzyms, die geändert werden, um nur in Anwesenheit eines startenden Moleküls wie Fluorid zu arbeiten. Die geänderten Enzyme werden zur Oberfläche eines Grobfilters gesprungen. Dann verwendet das Team ausgeführte Zellen, um Massenmengen eines möglicherweise therapeutischen Proteins zu erzeugen, von dem jedes Exemplar eine Subtilisinhülle hat, die zu ihm befestigt wird. Nachdem sie diese Proteine zusammen mit den Tausenden von anderen geerntet haben, die im zellulären Innenraum wachsen, filtern sie die Mischung durch das Grobfilter, in dem die Proteinhülle Paare schnell abgefangen und zum Subtilisin fest sind, während der Rest der Mischung weg ausläuft.

An diesem Punkt schlägt das Team ihren Schalter. Sie fügen ein Bit des Fluorids hinzu und das Enzym schnippelt das Anleihe zwischen der Hülle und Protein und gibt das gewünschte proteinfreie fast aller Verunreinigungen frei. „Die Technik kann möglicherweise verwendet werden, um jedes mögliches Protein zu erhalten, das Sie mögen, und der Prozess ist wiederholbares, während die Hüllen für eine andere Runde der Reinigung gelöscht werden können,“ Gallagher sagt. „Für die meisten Proteine, kann die Methode größer als 95 Prozent Reinheit an einem Einzelschritt erzielen.“

Das Forschungsteam umfaßt auch Bauteile von den Potomac-Affinitäts-Proteinen, von LLC (BREI) und von der Universität des Maryland-Biotechnologie-Instituts (UMBI). UMBI hält das Patent an, das zum BREI genehmigt worden ist. Die Forschung wurde durch Bewilligungen von den Nationalen Instituten der Gesundheit und vom Bill und von der Melinda Gates-Basis unterstützt.

* T. Gallagher, B. Ruan, M. London, M. Bryan und P.N. Bryan. Zelle eines schaltbaren Subtilisin komplex mit Substratfläche und mit dem Aktivatorazid. Biochemie, DATTEL, Seiten, DOI.

Last Update: 13. January 2012 15:23

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