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Le « Sur-Contact » Biochimique A Pu Résoudre le Défi de Purification de Protéine

Published on October 20, 2009 at 6:53 PM

Les Médicaments basés sur les protéines conçues représentent une frontière neuve pour les générateurs pharmaceutiques. Même après qu'ils découvrent une protéine qui peut former la base du prochain médicament de merveille, cependant, ils doivent confronter un problème de longue date : comment produire de grandes quantités de la protéine dans une condition hautement pure. Maintenant, une équipe de recherche multi-institutionnelle comprenant un biochimiste au National Institute of Standards and Technology (NIST) peut avoir le found* une solution neuve dans un « robot ménager enzymatique » qu'elles peuvent lancer à volonté.

L'étui (en vert en haut), avec la protéine désirée a lié à lui (en jaune à la droite), premier colle à l'enzyme conçue (dans l'atbottom bleu laissé) - permettant des impuretés et d'autres protéines à enlever. Alors une infusion de déclencher des molécules (points rouges) fait couper l'enzyme loin la protéine désirée (à la remarque où l'étui et la protéine connectent), qui peut être rassemblée en condition pure. L'étui peut alors être enlevé et le procédé répété. Crédit : NIST

L'équipe a trouvé une technique performante de moissonner les molécules de protéine épurées en modifiant une enzyme qui souillent l'utilisation de bactéries de décomposer leur nourriture. Sous sa forme naturelle, cette enzyme serait peu utile de doper des révélateurs, mais l'équipe l'a modifié de sorte qu'elle puisse être lancée au moment désiré. En produisant essentiellement un « sur-contact » pour l'activité enzymatique, l'équipe a trouvé une voie de séparer une protéine unique et désirée du mélange des milliers produits par une cellule vivante, qui demeure l'usine naturelle de la protéine de la biotechnologie du choix.

Les Bactéries utilisent l'enzyme, subtilisine appelée, en tant qu'une sorte de robot ménager : Après l'avoir produit intérieurement, elles déchargent l'enzyme dans la saleté, où elle utilise une « lame » minuscule pour hacher des protéines dans les pièces digestibles. Puisqu'elle pourrait endommager l'intérieur de la bactérie, la lame a un étui protecteur qui vient seulement hors circuit une fois l'enzyme a quitté la cellule.

« L'enzyme et l'étui sont fortement attirés entre eux. L'enzyme agissent d'abord est de couper l'étui loin, » dit Travis Gallagher du NIST. « La méthode tire profit de leur attraction afin d'isoler la protéine que nous voulons. »

L'équipe produit d'abord beaucoup de copies « sheathless » de l'enzyme, qui sont modifiées pour fonctionner seulement en présence d'une molécule de déclenchement telle que le fluorure. Les enzymes modifiées sont liées sur la surface d'un tamis. Alors l'équipe utilise les cellules conçues pour produire des quantités de masse d'une protéine potentiellement thérapeutique, chaque copie dont a un étui de subtilisine fixé à lui. Après moisson de ces protéines avec les milliers d'autres qui se développent dans l'intérieur cellulaire, elles filtrent le mélange à l'aide du tamis, où les paires de protéine-étui sont attrapées et coincées rapidement à la subtilisine tandis que le reste du mélange s'écoule loin.

En ce point, l'équipe passe rapidement leur contact. Ils ajoutent un morceau de fluorure et l'enzyme coupe l'obligation entre l'étui et la protéine, relâchant le sans protéines désiré de presque toutes les impuretés. « La technique peut peut-être être employée pour obtenir n'importe quelle protéine que vous aimez, et le procédé est, pendant que les étuis peuvent être retirés pour un autre rond de la purification, » Gallagher reproductible dit. « Pour la plupart des protéines, la méthode peut réaliser plus grand que 95 pour cent de pureté à un pas à pas. »

L'équipe de recherche inclut également des membres des Protéines d'Affinité de Potomac, du LLC (PAP) et de l'Institut de Biotechnologie d'Université du Maryland (UMBI). UMBI retient le brevet, qui a été qualifié au PAP. La recherche a été supportée par des concessions des Instituts de la Santé Nationaux et du Bill et de la Fondation de Melinda Gates.

* T. Gallagher, B. Ruan, M. Londres, M. Bryan et P.N. Bryan. Structure d'une subtilisine permutable complexée avec le substrat et avec de l'azoture d'activateur. Biochimies, DATE, pages, DOI.

Last Update: 13. January 2012 14:40

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