O “Em-Interruptor Bioquímico” Podia Resolver o Desafio da Purificação da Proteína

Published on October 20, 2009 at 6:53 PM

As Drogas baseadas em proteínas projetadas representam uma fronteira nova para fabricantes farmacêuticos. Mesmo depois que descobrem uma proteína que possa formar a base da droga de maravilha seguinte, contudo, elas têm que confrontar um problema de longa data: como produzir grandes quantidades da proteína em um estado altamente puro. Agora, uma equipa de investigação multi-institucional que inclui um bioquímico no National Institute of Standards and Technology (NIST) pode ter o found* uma solução nova em um “robô de cozinha enzimático” que podem activar na vontade.

A bainha (no verde na parte superior), com a proteína desejada ligou-lhe (no amarelo no direito), primeiro cola à enzima projetada (no atbottom azul deixado) - permitindo as impurezas e as outras proteínas a ser lavadas afastado. Então uma infusão de provocar moléculas (pontos vermelhos) faz com que a enzima corte afastado a proteína desejada (no ponto onde a bainha e a proteína conectam), que pode ser recolhida em um estado puro. A bainha pode então ser lavada afastado e o processo repetido. Crédito: NIST

A equipe encontrou um método eficiente de colher as moléculas de proteína refinadas alterando uma enzima que sujam o uso das bactérias dividir seu alimento. Em seu formulário natural, esta enzima seria de pouco uso drogar reveladores, mas a equipe alterou-o de modo que pudesse ser activado no momento desejado. Criando essencialmente um “em-interruptor” para a actividade de enzima, a equipe encontrou uma maneira de separar uma única, proteína desejada da mistura dos milhares gerados por uma pilha viva, que permanecesse fábrica natural da proteína da biotecnologia de escolha.

As Bactérias usam a enzima, chamada subtilisin, como meio um robô de cozinha: Após ter produzido o internamente, liberam a enzima no solo, onde usa uma “lâmina minúsculo” para desbastar acima proteínas em partes digestíveis. Porque poderia danificar o interior da bactéria, a lâmina tem uma bainha protectora que venha somente fora uma vez a enzima retire a pilha.

“A enzima e a bainha são atraídas fortemente entre si. A enzima actua primeiramente é cortar afastado a bainha,” diz o Travis Gallagher do NIST. “O método aproveita-se de sua atracção a fim isolar a proteína que nós queremos.”

A equipe cria primeiramente muitas cópias “sheathless” da enzima, que são alteradas para funcionar somente na presença de uma molécula de provocação tal como o fluoreto. As enzimas alteradas são limitadas à superfície de um filtro. Então a equipe usa pilhas projetadas para gerar quantidades em massa de uma proteína potencial terapêutica, cada cópia de que tem uma bainha do subtilisin anexada a ela. Após ter colhido estas proteínas junto com os milhares de outro que crescem no interior celular, filtram a mistura através do filtro, onde os pares da proteína-bainha estão travados e colados rapidamente ao subtilisin quando o resto da mistura drenar afastado.

Neste momento, a equipe passa rapidamente seu interruptor. Adicionam um bit do fluoreto e a enzima corta a ligação entre a bainha e a proteína, liberando a proteína desejada - livre de quase todas as impurezas. “A técnica pode concebìvel ser usada para obter toda a proteína que você gostar, e o processo é, enquanto as bainhas podem ser removidas para um outro círculo da purificação,” Gallagher repetível diz. “Para a maioria de proteínas, o método pode conseguir maior de 95 por cento de pureza em uma única etapa.”

A equipa de investigação igualmente inclui membros das Proteínas da Afinidade de Potomac, do LLC (PAP) e do Instituto da Biotecnologia da Universidade de Maryland (UMBI). UMBI guardara a patente, que foi licenciada ao PAP. A pesquisa foi apoiada por concessões dos Institutos de Saúde Nacionais e do Bill e da Fundação de Melinda Gates.

* T. Gallagher, B. Ruan, M. Londres, M. Bryan e P.N. Bryan. Estrutura de um subtilisin switchable complexed com carcaça e com o azotureto do activador. Bioquímica, TÂMARA, páginas, DOI.

Last Update: 13. January 2012 12:53

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