Posted in | Microscopy | Nanoanalysis

Brug af optisk mikroskopi til Billed objekter med opløsninger så små som 0,5 nanometer

Published on July 14, 2010 at 8:01 PM

Konventionel visdom hævder, at optisk mikroskopi ikke kan bruges til at "se" noget så lille som et enkelt molekyle. Men videnskaben har endnu engang væltet konventionelle visdom. Secretary of Energy, nobelprisvinder og tidligere direktør for Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) Steven Chu ledet udviklingen af en teknik, der muliggør brugen af optiske mikroskopi til billede objekter eller afstanden mellem dem med opløsninger så små som 0,5 nanometer - halvdelen af ​​en milliarddel af en meter, eller en størrelsesorden mindre end den tidligere bedste.

Grafen til venstre viser, at med den aktive feedback-system ud er der en opløsning drift på omkring 0,3 pixels eller 19 nanometer, men med feedback-system på beslutningen fastholdes på bedre end 0,01 pixels, eller cirka 0,64 nanometer. Billedet til højre viser de enkelte Cyanine (CY) fluorescerende farvestof molekyler - Cy3 og Cy5 - bruges til at mærke 20 basepar af dobbelt-strenget DNA.

"Evnen til at få sub-nanometer opløsning i biologisk relevante vandige miljøer har potentialet til at revolutionere biologien, især strukturelle biologi," siger sekretær Chu. "En af begrundelserne for dette arbejde, for eksempel, var at måle afstande mellem proteiner, der danner multi-domæne, meget komplekse strukturer, såsom protein forsamling, der udgør den menneskelige RNA polymerase II-system, der indleder DNA transskription."

Sekretær Chu er medforfatter til en papir nu optræder i tidsskriftet Nature, der beskriver denne forskning. Papiret har titlen "Subnanometre enkelt-molekyle lokalisering, registrering og distance målinger." De andre forfattere er Alexandros Pertsinidis, en post-ph.d.-forsker og medlem af Chu forskergruppe ved University of California (UC) Berkeley, som nu er en assisterende professor ved Sloan-Kettering Institute, og Yunxiang Zhang, et medlem af Chu forskning gruppe på Stanford University.

Ifølge en lov i fysik kendt som "diffraktion grænse," det mindste billede, et optisk system kan løse, er omkring halvdelen af ​​bølgelængden af ​​det lys, der anvendes til at producere dette billede. For konventionel optik, svarer det til omkring 200 nanometer. Til sammenligning, måler en DNA-molekyle omkring 2,5 nanometer i bredden.

Mens ikke-optiske billeddannende systemer, såsom elektronmikroskoper, kan løse genstande langt ind i subnanometer skala, disse systemer opererer under betingelser, der ikke ideel til studiet af biologiske prøver. Afsløring individuelle fluorescerende etiketter anbragt på biologiske molekyler af interesse ved hjælp af charge-koblede enheder (CCD'er) - arrays af silicium-chips, der omdanner indkommende lys til en elektrisk ladning, har givet resolutioner, som fint som fem nanometer. Men indtil nu denne teknologi har været i stand til billede enkelte molekyler eller afstande mellem et par af molekyler meget mindre end 20 nanometer.

Chu og hans medforfattere var i stand til at bruge den samme CCD-fluorescens-teknologi til at løse afstande med subnanometer præcision og nøjagtighed ved at korrigere et trick af lyset. De elektriske ladninger i et CCD-array oprettes, når fotoner strejke silicium og løsne elektroner, med styrken af ​​den afgift, der proportionalt med intensiteten af ​​hændelsen fotoner. Men afhængig af præcist, hvor en foton rammer overfladen af ​​en silicium-chip, kan der være en lille forskel i, hvordan foton er absorberet, og om det genererer en målelig afgift. Denne ikke-ensartethed i svaret af CCD silicium array til indkommende fotoner, som sandsynligvis er en artefakt af chippen fremstillingsprocessen, resulterer i en sløring af pixels, der gør det vanskeligt at løse to punkter, der er inden for et par nanometer af hinanden .

"Vi har udviklet en aktiv feedback-system, der giver os mulighed for at placere billedet af en enkelt fluorescerende molekyle overalt på CCD-array med sub-pixel præcision, hvilket igen gør os i stand til at arbejde i et område mindre end den typiske tre pixel længde-skala af CCD uhomogenitet, "siger Pertsinidis, som er ledende forfatter på Nature papiret. "Med denne feedback systemet plus brug af ekstra optisk bjælker for at stabilisere et mikroskop system, kan vi skabe en kalibreret område på silicium-array, hvor fejlen skyldes manglende ensartethed er reduceret til 0,5 nanometer. Ved at placere de molekyler, vi ønsker at måle i centrum af denne region, vi kan få subnanometer opløsning ved hjælp af en konventionel optisk mikroskop, som du kan finde i nogen biologi lab. "

Chu siger, at evnen til at flytte fase af et mikroskop små afstande og beregne geometriske centrum (tyngdepunkt) af billedet gør det muligt ikke blot at måle foto-respons uhomogenitet mellem pixels, men også til at måle uhomogenitet inden for hver enkelt pixel.

"Med denne viden uhomogenitet så giver os mulighed for at foretage rettelser mellem den tilsyneladende position og den virkelige stilling billedets geometriske tyngdepunkt," siger Chu. "Siden denne ikke-enslydende svar er bygget ind i CCD-array og ikke ændres fra dag til dag, vores aktive feedback-system giver os mulighed for til billede flere gange på samme position CCD-array."

Pertsinidis fortsætter med at arbejde med Chu og andre i gruppen om den videre udvikling og anvendelse af denne super-opløsning teknik. Ud over de menneskelige RNA polymerase II-systemet, er han og gruppen bruger det til at bestemme strukturen af ​​epithelial cadherin molekyler, der er ansvarlige for den celle-til-celle adhæsion, der indeholder væv og andre biologiske materialer sammen. Pertsinidis, Zhang, og en anden postdoc i Chu forskningsgruppe, Sang Ryul Park, der også bruger denne teknik til at skabe 3D-målinger af de molekylære organisation inde hjerneceller.

"Ideen er at bestemme strukturen og dynamikken i vesikel fusion proces, der frigiver neurotransmitter molekyler bruges af neuroner til at kommunikere med hinanden," Pertsinidis siger. "Lige nu er vi på vej in situ målinger med en opløsning på omkring 10 nanometer, men vi tror, ​​vi kan skubbe denne beslutning til inden for to nanometer."

I et samarbejde med Joe Gray, Berkeley Lab er Associate Director for Life Sciences og en førende kræftforsker, postdocs i Chu forskergruppe også bruger den super-opløsning teknik til at studere fastgørelse af signalstoffer på RAS protein, som har været knyttet til en række kræftformer, herunder bryst-, bugspytkirtel, lunge og tyktarm. Denne forskning kan hjælpe med at forklare, hvorfor kræft behandlingsformer, der klarer sig godt på nogle patienter er ineffektive på andre.

Ud over sin biologiske applikationer, siger Pertsinidis, Zhang og Chu i deres Nature papir deres super opløsning teknik skal også vise sig værdifulde til at karakterisere og designe præcision fotometriske billeddannende systemer i atom-fysik eller astronomi, og giver mulighed for nye værktøjer inden for optisk litografi og nanometrologi .

Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health, National Science Foundation, National Aeronautics and Space Administration, og Defense Advanced Research Projects Agency.

Last Update: 3. October 2011 02:53

Tell Us What You Think

Do you have a review, update or anything you would like to add to this news story?

Leave your feedback
Submit