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Utilisant la microscopie optique à des objets d'image avec des résolutions aussi petites que 0,5 nanomètres

Published on July 14, 2010 at 8:01 PM

La sagesse conventionnelle veut que la microscopie optique ne peut pas être utilisé pour "voir" quelque chose d'aussi petit qu'une molécule individuelle. Mais la science a de nouveau annulé la sagesse conventionnelle. Secrétaire de l'Énergie, lauréat du prix Nobel et ancien directeur de l' Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) , Steven Chu, a dirigé l'élaboration d'une technique qui permet l'utilisation de la microscopie optique à des objets image ou la distance entre eux avec des résolutions aussi petites que 0,5 nanomètres - un demi de un milliardième de mètre, ou un ordre de grandeur plus petite que la précédente meilleure.

Graphique sur la gauche montre que le système de rétroaction active off il ya une dérive résolution d'environ 0,3 pixels ou 19 nanomètres, mais avec le système de rétroaction sur la résolution est maintenue à moins de 0,01 pixels, soit environ 0,64 nanomètres. Image sur le droit individuel montre Cyanine (Cy) molécules de colorant fluorescent - Cy3 et Cy5 - utilisé pour étiqueter 20 paires de bases d'ADN double brin.

«La capacité d'obtenir résolution sub-nanométrique dans les environnements aqueux biologiquement pertinente a le potentiel de révolutionner la biologie, en particulier la biologie structurale», explique le secrétaire Chu. «Une des motivations de ce travail, par exemple, était de mesurer les distances entre les protéines qui forment multi-domaine, des structures très complexes, telles que l'assemblage protéine qui forme l'ARN polymérase II humaine du système, qui initie la transcription d'ADN."

Secrétaire Chu est le co-auteur d'un document apparaît maintenant dans la revue Nature qui décrit cette recherche. Le document est intitulé "Subnanometre molécule unique de localisation, d'enregistrement et les mesures de distance." Les autres auteurs sont Alexandros Pertsinidis, un chercheur post-doctoral et membre du groupe de recherche de Chu à l'Université de Californie (UC) à Berkeley, qui est maintenant professeur adjoint à l'Institut Sloan-Kettering, et Yunxiang Zhang, un membre de la recherche de Chu groupe à l'Université de Stanford.

Selon une loi de la physique connue comme la "limite de diffraction», la plus petite image qui un système optique peut résoudre est d'environ la moitié de la longueur d'onde de la lumière utilisée pour produire cette image. Pour les optiques conventionnelles, ce qui correspond à environ 200 nanomètres. Par comparaison, une molécule d'ADN mesures environ 2,5 nanomètres de largeur.

Alors que les systèmes d'imagerie non-optiques, tels que les microscopes électroniques, peuvent résoudre bien des objets dans l'échelle subnanometer, ces systèmes fonctionnent dans des conditions pas idéales pour l'étude d'échantillons biologiques. Détection individuelle des étiquettes fluorescentes attachés à des molécules biologiques d'intérêt en utilisant des dispositifs à couplage de charge (CCD) - tableaux de puces de silicium qui convertissent la lumière entrant dans une charge électrique, a donné des résolutions aussi fine que cinq nanomètres. Cependant, jusqu'à maintenant cette technologie a été incapable de molécules seule image ou les distances entre une paire de molécules beaucoup moins que 20 nanomètres.

Chu et ses co-auteurs ont pu utiliser le même capteur CCD-fluorescence technologie pour résoudre les distances avec une précision et d'exactitude subnanometer en corrigeant une astuce de la lumière. Les charges électriques dans une matrice CCD sont créés lorsque les photons grève le silicium et déloger les électrons, avec la force de la charge étant proportionnelle à l'intensité des photons incidents. Toutefois, selon précisément là où un photon frappe la surface d'une puce de silicium, il peut y avoir une légère différence dans la façon dont le photon est absorbé et si elle génère une charge mesurable. Cette non-uniformité de la réponse de la matrice CCD de silicium pour les photons entrants, ce qui est probablement un artefact du processus de fabrication de puces, les résultats dans un flou de pixels qui la rend difficile à résoudre deux points qui sont au sein de quelques nanomètres d'un autre .

«Nous avons développé un système de rétroaction active qui nous permet de placer l'image d'une seule molécule fluorescente n'importe où sur la matrice CCD avec précision sous-pixel, qui à son tour nous permet de travailler dans une région plus petite que la longueur typique de trois pixels échelle du CCD non-uniformité », explique Pertsinidis, qui est le principal auteur de l'article de Nature. «Avec ce système de rétroaction ainsi que l'utilisation de faisceaux optiques supplémentaires pour stabiliser le système microscope, nous pouvons créer une région calibrées sur le tableau de silicium, où l'erreur due à la non-uniformité est réduite à 0,5 nanomètres. En plaçant les molécules que nous voulons mesurer dans le centre de cette région, nous pouvons obtenir une résolution subnanometer aide d'un microscope optique classique que vous pouvez trouver dans n'importe quel laboratoire de biologie. "

Chu affirme que la capacité de déplacer la scène d'un petit microscope distances et calculer le centre géométrique (centroïde) de l'image permet de mesurer non seulement la photo-réponse non-uniformité entre les pixels, mais aussi de mesurer la non-uniformité au sein de chaque pixel.

"Connaissant cette non-uniformité nous permet ensuite de faire des corrections entre la position apparente et la position réelle du centre de gravité de l'image», explique Chu. «Depuis cette non-réponse uniforme est intégré dans le capteur CCD et ne change pas de jour en jour, notre système de rétroaction active nous permet de l'image à plusieurs reprises à la même position de la matrice CCD."

Pertsinidis continue à travailler avec Chu et autres membres du groupe sur le développement et l'application de cette technique de super-résolution. En plus de l'ARN polymérase II humaine du système, lui et le groupe s'en servent pour déterminer la structure des molécules cadhérine épithéliale qui sont responsables de l'adhésion de cellule à cellule qui détient les tissus et autres matériaux biologiques ensemble. Pertsinidis, Zhang, et un autre postdoc dans le groupe de recherche de Chu, Sang Ryul Park, utilisent également cette technique pour créer des mesures 3D de l'organisation moléculaire à l'intérieur des cellules du cerveau.

«L'idée est de déterminer la structure et la dynamique du processus de fusion des vésicules qui libère les molécules de neurotransmetteur utilisé par les neurones de communiquer entre eux», dit Pertsinidis. «En ce moment nous recevons des mesures in situ avec une résolution d'environ 10 nanomètres, mais nous pensons que nous pouvons pousser la présente résolution au sein de deux nanomètres."

Dans une collaboration avec Joe Gray, directeur associé Berkeley Lab pour les sciences de la vie et un chercheur sur le cancer de premier plan, post-doctorants dans le groupe de recherche de Chu sont également en utilisant la technique super-résolution pour étudier la fixation de molécules de signalisation sur la protéine Ras, qui a été liée à un certain nombre de cancers, dont ceux du sein, du pancréas, du poumon et du côlon. Cette recherche pourrait aider à expliquer pourquoi les thérapies du cancer qui se comportent bien sur certains patients sont inefficaces sur les autres.

En plus de ses applications biologiques, Pertsinidis, Zhang et Chu dans leur article de Nature affirment que leur technique de super-résolution devrait également se révéler précieux pour caractériser et concevoir des systèmes d'imagerie de précision photométrique en physique atomique ou l'astronomie, et permettent de nouveaux outils de lithographie optique et nanométrologie .

Cette recherche a été financée par le National Institutes of Health, la National Science Foundation, la National Aeronautics and Space Administration et la Defense Advanced Research Projects Agency.

Last Update: 9. October 2011 12:21

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