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Usando a Microscopia Óptica à Imagem Objeta com as Definições tão Pequenas quanto 0,5 Nanômetros

Published on July 14, 2010 at 8:01 PM

A Sabedoria popular sustenta que a microscopia óptica não pode ser usada “considera” algo tão pequeno quanto uma molécula individual. Mas a ciência tem virado mais uma vez a sabedoria popular. O Secretário de Energia, o Prémio Nobel e o director anterior do Laboratório Nacional de Lawrence Berkeley (Laboratório) Steven Chu de Berkeley conduziram a revelação de uma técnica que permitisse o uso da microscopia óptica aos objetos da imagem ou da distância entre elas com as definições tão pequenas quanto 0,5 nanômetros - um meio de um bilionésimo de um medidor, ou um ordem de grandeza menor do que o melhor precedente.

O Gráfico na esquerda mostra que com o sistema de feedback activo fora há uma tracção da definição de aproximadamente 0,3 pixéis ou de 19 nanômetros, mas com o sistema de feedback na definição é mantido em melhor de 0,01 pixéis, ou em aproximadamente 0,64 nanômetros. A Imagem no direito mostra a Cianina individual (Cy) as moléculas de tintura fluorescente - Cy3 e Cy5 - usadas para etiquetar 20 pares baixos de ADN dobro-encalhado.

“A capacidade para obter uma definição de secundário-nanômetro em ambientes aquosos biològica relevantes tem o potencial revolucionar a biologia, biologia particularmente estrutural,” diz o Secretário Chu. “Uma das motivações para esta trabalho, por exemplo, era medir distâncias entre as proteínas que formam o multi-domínio, estruturas altamente complexas, tais como o conjunto da proteína que forma o sistema humano da polimerase de RNA II, que inicia a transcrição do ADN.”

O Secretário Chu é o co-autor de um papel que aparece agora na Natureza do jornal que descreve esta pesquisa. O papel é intitulado de “localização da único-molécula Subnanometre, registo e medidas da distância.” Os outros autores são Alexandros Pertsinidis, um pesquisador cargo-doutoral e membro do grupo de investigação de Chu na Universidade Da California (UC) Berkeley, que é agora um professor adjunto no Instituto de Sloan-Kettering, e do Yunxiang Zhang, um membro do grupo de investigação de Chu na Universidade de Stanford.

De acordo com uma lei de física conhecida como de “o limite difracção,” a imagem a menor que um sistema óptico pode resolver é sobre a metade do comprimento de onda da luz usada para produzir essa imagem. Para o sistema ótico convencional, isto corresponde a aproximadamente 200 nanômetros. Pela comparação, uma molécula do ADN mede aproximadamente 2,5 nanômetros na largura.

Quando os sistemas não-ópticos da imagem lactente, tais como microscópios electrónicos, puderem resolver objetos bem na escala do subnanometer, estes sistemas operam-se sob as circunstâncias nao ideais para o estudo de amostras biológicas. Detectando as etiquetas fluorescentes individuais anexadas às moléculas biológicas do interesse usando dispositivos carga-acoplados (CCDs) - as disposições de chip de silicone que convertem a luz entrante em uma carga elétrica, renderam definições tão muito bem quanto cinco nanômetros. Contudo, até aqui esta tecnologia foi incapaz moléculas ou às distâncias da imagem às únicas entre um par de moléculas muito menos de 20 nanômetros.

Chu e seus co-autores podiam usar a mesma tecnologia da CCD-fluorescência para resolver distâncias com precisão e precisão do subnanometer corrigindo um truque da luz. As cargas elétricas em uma disposição do CCD são criadas quando os fotão golpeiam o silicone e desalojam elétrons, com a força da carga que é proporcional à intensidade dos fotão do incidente. Contudo, segundo precisamente onde um fotão bate a superfície de um chip de silicone, pode haver uma diferença ligeira em como o fotão é absorvido e em se gera uma carga mensurável. Esta não uniformidade na resposta da disposição do silicone do CCD aos fotão entrantes, que é provavelmente um produto manufacturado do processo de manufactura da microplaqueta, conduz a um borrão dos pixéis que faça difícil resolver dois pontos que estão dentro de alguns nanômetros de um outros.

“Nós desenvolvemos um sistema de feedback activo que permitisse que nós coloquem a imagem de uma única molécula fluorescente em qualquer lugar na disposição do CCD com precisão do secundário-pixel, que nos permite por sua vez de trabalhar em uma região menor do que a comprimento-escala típica de três pixéis da não uniformidade do CCD,” dizemos Pertsinidis, que é o autor principal no papel da Natureza. “Com este sistema de feedback mais o uso de feixes ópticos adicionais estabilizar o sistema do microscópio, nós podemos criar uma região calibrada na disposição do silicone onde o erro devido à não uniformidade é reduzido a 0,5 nanômetros. Colocando as moléculas nós queremos medir no centro desta região que nós podemos obter a definição do subnanometer usando um microscópio óptico convencional que você possa encontrar em todo o laboratório de biologia.”

Chu diz que a capacidade para mover a fase de distâncias pequenas de um microscópio e para calcular o centro geométrico (centróide) da imagem torna possível medir não somente a não uniformidade da foto-resposta entre pixéis, mas para medir igualmente a não uniformidade dentro de cada pixel individual.

“Conhecer esta não uniformidade permite então que nós façam correcções entre a posição aparente e a posição real do centróide da imagem,” diz Chu. “Desde Que esta resposta do não-uniforme é construída na disposição do CCD e não muda de um dia para o outro, nosso sistema de feedback activo permite-nos à imagem repetidamente na mesma posição da disposição do CCD.”

Pertsinidis está continuando a trabalhar com Chu e outro no grupo na revelação e na aplicação mais adicionais desta técnica da super-definição. Além do que o sistema humano da polimerase de RNA II, e o grupo estão usando-o para determinar a estrutura das moléculas Epiteliais do cadherin que são responsáveis para a adesão da pilha-à-pilha que mantem o tecido e outros materiais biológicos unidos. Pertsinidis, Zhang, e um outro postdoc no grupo de investigação de Chu, Cantaram o Parque de Ryul, igualmente estão usando esta técnica para criar as medidas 3D da organização molecular dentro dos neurónios.

“A ideia é determinar a estrutura e dinâmica do processo da fusão da vesícula que libera as moléculas do neurotransmissor usadas pelos neurônios para se comunicar um com o outro,” Pertsinidis diz. “Agora nós estamos obtendo medidas in situ com uma definição de aproximadamente 10 nanômetros, mas nós pensamos que nós podemos empurrar esta definição para dentro dois nanômetros.”

Em uma colaboração com Cinza de Joe, o Director Adjunto do Laboratório de Berkeley para Ciências da Vida e um pesquisador principal do cancro, postdocs no grupo de investigação de Chu igualmente estão usando a técnica da super-definição para estudar o acessório de moléculas da sinalização na proteína de RAS, que foi ligada a um número de cancros, incluindo aqueles do peito, o pâncreas, o pulmão e os dois pontos. Esta pesquisa poderia ajudar a explicar porque as terapias do cancro que executam bem em alguns pacientes são ineficazes em outro.

Além do que suas aplicações biológicas, Pertsinidis, Zhang e Chu em seu papel da Natureza dizem que sua técnica da super-definição deve igualmente provar o artigo de valor caracterizar e projectar sistemas fotométricos da imagem lactente da precisão na física atômica ou na astronomia, e permitem novas ferramentas na litografia óptica e no nanometrology.

Esta pesquisa foi apoiada pelos Institutos de Saúde Nacionais, pelo National Science Foundation, pela NASA, e pelo Defense Advanced Research Projects Agency.

Last Update: 12. January 2012 00:26

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