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Los temas cubiertos
Fondo
Desnaturalización de las proteínas
Dispersión de luz dinámica para la caracterización de las proteínas
El punto de fusión de proteínas
Factores que afectan el punto de fusión de proteínas
El Malvern Zetasizer Nano Sistema
Fondo
Las proteínas se componen de cadenas de polipéptidos, sintetizados en la célula de un grupo de 20 tipos distintos de aminoácidos. A diferencia de los polímeros artificiales y de la bobina al azar biológico, cadenas de polipéptidos de las proteínas se pliegan en exclusiva tres dimensiones de estructuras en el estado de humor. Estas estructuras se estabilizan por una combinación de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas, junto con la formación de múltiples enlaces de hidrógeno entre las cadenas laterales de los aminoácidos dentro de la estructura.
Desnaturalización de las proteínas
Las proteínas se desarrolló para realizar funciones específicas dentro de los sistemas biológicos, como catalizador de las reacciones y el transporte de pequeñas moléculas o iones. Esta funcionalidad requiere un alto grado de flexibilidad dentro de la estructura de la proteína. Por lo tanto, las interacciones estabilización de la estructura de la proteína son suficientes para mantener la estructura dentro de un estrecho rango de condiciones ambientales. Si las condiciones de solución se encuentra fuera de este rango, por ejemplo, a través de un cambio en el pH o la temperatura, la desnaturalización entrópica impulsado o despliegue rápido puede ocurrir. Cuando se produce la desnaturalización, el pequeño tamaño de la proteína se incrementa a un valor coherente con un polímero de la bobina al azar del mismo peso molecular. En ausencia de caotrópico (agregación de prohibir) los agentes, entre los polímeros interacciones hidrofóbicas puede llevar rápidamente a la agregación no específica de las cadenas de polipéptidos desnaturalizados. Una representación del proceso de desnaturalización, junto con el posterior cambio de tamaño se muestra en la Figura 1.
Figura 1. Esquema que detalla el proceso de desnaturalización de las proteínas y el posterior cambio de tamaño hidrodinámico indicado por el diámetro del círculo sólido.
Dispersión de luz dinámica para la caracterización de las proteínas
Dispersión de luz dinámica (DLS) ha sido utilizado como una herramienta de caracterización de proteínas. En DLS, el movimiento browniano de las partículas se mide, y el tamaño hidrodinámica se calcula utilizando la ecuación de Stokes-Einstein. La sensibilidad de DLS es suficiente para distinguir diferentes estados de la proteína oligomérica y cuaternario, y es ideal para el control de la estabilidad de la estructura de las proteínas a las condiciones de desnaturalización.
El punto de fusión de proteínas
El punto de fusión de proteínas (TM) se define como la temperatura a la que desnaturaliza las proteínas. El cambio en el tamaño que acompaña a la desnaturalización de la proteína se identifica fácilmente mediante técnicas de DLS. Considere la figura 2, por ejemplo, que muestra la temperatura depende de Z-media de diámetro y la intensidad de la dispersión de ovoalbúmina en tampón fosfato salino (PBS), medido con un Zetasizer Nano ZS . A temperaturas inferiores a 71 ° C, el tamaño y la intensidad de dispersión son constantes, lo que sugiere una estructura terciaria estable. A 71 ° C o más, el tamaño y la intensidad de dispersión aumentan exponencialmente con la temperatura, lo que indica la presencia de agregados desnaturalizado.
Figura 2. Rastro de fusión y punto de histéresis para la ovoalbúmina en PBS.
Factores que afectan el punto de fusión de proteínas
Debido a la secuencia única de aminoácidos primaria asociada con los tipos de proteínas específicas, los puntos de fusión pueden variar significativamente. Las condiciones de las soluciones, por ejemplo el pH y la concentración de sal, y después de las modificaciones de traslación, por ejemplo, glicosilación, también pueden tener una marcada influencia en la estabilidad de la estructura de las proteínas y por lo tanto la temperatura de fusión. Las mediciones del punto de fusión son, pues, un paso importante en la caracterización total de la proteína diana, sobre todo si la proteína está destinada a la integración en un producto farmacéutico o formulación. La Figura 3 muestra las huellas del punto de fusión de una serie de proteínas en PBS. Las mediciones automáticas fueron recogidos con un Zetasizer Nano ZS , con una rampa de 1 ° C la temperatura incremental y un tiempo de equilibrio de 3 minutos en cada medición de temperatura.
Figura 3. Rastros de fusión punto y los valores de TM para una serie de proteínas en PBS.
El Malvern Zetasizer Nano Sistema
El Zetasizer Nano ZS de Malvern Instruments es el primer instrumento comercial para incluir el hardware y software para combinar medidas de dispersión dinámica, estática, y electroforesis de luz, dando a los investigadores una amplia gama de propiedades de la muestra, incluyendo el tamaño, peso molecular, y el potencial zeta . El sistema fue diseñado específicamente para satisfacer las necesidades de baja concentración y volumen de la muestra típicamente asociados con aplicaciones farmacéuticas y biomolecular, junto con los requisitos para las aplicaciones de alta concentración coloidal. La satisfacción de esta mezcla única de requisitos se llevó a cabo a través de la integración de un sistema de retro-reflexión óptica y el diseño de una cámara de celular novela. Como consecuencia de estas características, el Zetasizer Nano ZS especificaciones de tamaño de la muestra y la concentración superiores a los de cualquier otro instrumento DLS otros disponibles en el mercado, con un rango de tamaño de 0.6Nm a 6um, y un rango de concentración de 0.1mg/mL lisozima a 40% w / v. Como bono adicional, el Zetasizer Nano ZS es la optimización de hardware libre y el software incluye un exclusivo "un clic" medir, analizar, y cuentan con el informe diseñado para minimizar la curva de aprendizaje de nuevos usuarios.