Caracterización del Punto de fusión de las Proteínas Usando el Sistema Nano de Zetasizer de los Instrumentos de Malvern

Temas Revestidos

Antecedentes
Desnaturalización de Proteínas
Dispersión Luminosa Dinámica para la Caracterización de Proteínas
El Punto de fusión de la Proteína
Factores Que Afectan al Punto de fusión de Proteínas
El Sistema Nano de Malvern Zetasizer

Antecedentes

Las Proteínas se componen de encadenamientos del polipéptido, sintetizado dentro de la célula de un centro común de 20 diversos tipos del aminoácido. En contraste con los polímeros biológicos de la bobina artificial y al azar, los encadenamientos del polipéptido de la proteína plegable en las estructuras de 3 dimensiones únicas en el estado natured. Estas estructuras se estabilizan por una combinación de acciones recíprocas electroestáticas e hidrofóbicas, junto con la formación de bonos de hidrógeno múltiples entre las cadenas laterales de los aminoácidos dentro de la estructura.

Desnaturalización de Proteínas

Las Proteínas fueron desarrolladas para realizar funciones específicas dentro de sistemas biológicos, tales como catálisis de reacciones y transportar las pequeños moléculas o iones. Estas funciones necesitan un grado grande de adaptabilidad dentro de la estructura de la proteína. Como tal, las acciones recíprocas que estabilizan la estructura de la proteína son apenas suficientes mantener la estructura dentro de un estrecho rango de condiciones ambientales. Si las condiciones de la solución están fuera de este rango, e.g a través de un cambio en el pH o la temperatura, la desnaturalización o el despliegue entropically impulsada puede ocurrir rápidamente. Cuando ocurre la desnaturalización, el tamaño pequeño de la proteína se aumenta a un valor constante con un polímero al azar de la bobina del mismo peso molecular. En ausencia (agregación que prohíbe) de agentes chaotropic, las acciones recíprocas hidrofóbicas del inter-polímero pueden llevar rápidamente a la agregación no específica de los encadenamientos desnaturalizados del polipéptido. Una representación del proceso de la desnaturalización, junto con el cambio subsiguiente de tamaño se muestra en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Diagrama Esquemático que detalla el proceso de la desnaturalización de la proteína y el cambio subsiguiente en la talla hidrodinámica indicada por el diámetro del círculo sólido.

Dispersión Luminosa Dinámica para la Caracterización de Proteínas

La dispersión luminosa Dinámica (DLS) se ha utilizado de largo como herramienta de la caracterización de la proteína. En DLS, el movimiento Browniano de las partículas se mide, y la talla hidrodinámica se calcula usando la ecuación de Alimentar-Einstein. La sensibilidad de DLS es suficiente distinguir diversos estados oligoméricos y cuaternarios de la proteína, y se adapta idealmente para vigilar la estabilidad de la estructura de la proteína a desnaturalizar condiciones.

El Punto de fusión de la Proteína

El punto de fusión de la proteína (TM) se define como la temperatura en la cual la proteína desnaturaliza. El cambio de tamaño que acompañe la desnaturalización de la proteína se determina fácilmente usando técnicas de DLS. Considere el Cuadro 2 por ejemplo, que muestra a temperatura el diámetro Z-Medio relacionado e intensidad el dispersar para la Ovalbumina en salino protegida fosfato (PBS) medido con un Zetasizer ZS Nano. En las temperaturas menos que 71°C, la talla y la intensidad el dispersar son constante, sugiriendo una estructura terciaria estable. En 71°C y más alto, la talla y dispersar aumento de la intensidad exponencial con la temperatura, indicando la presencia de agregados desnaturalizados.

Cuadro 2. trazo e histéresis del Punto de fusión para la Ovalbumina en PBS.

Factores Que Afectan al Punto de fusión de Proteínas

Debido a la serie primaria única de los aminoácidos asociados a los tipos específicos de la proteína, los puntos de fusión pueden diferir importante. Las Soluciones condicionan, e.g. pH y concentración de la sal, y asientan modificaciones de translación, e.g el glycosylation, puede también tener una influencia marcada en la estabilidad de la estructura de la proteína y por lo tanto de la temperatura que funde. Las mediciones del Punto de fusión entonces son un paso de progresión importante en la caracterización total de la proteína de la meta, determinado si la proteína es destinada para la integración en un producto farmacéutico o una formulación. El Cuadro 3 muestra los trazos del punto de fusión para una serie de proteínas en PBS. Las mediciones automatizadas cerco con un Zetasizer ZS Nano, usando una rampa ampliada de la temperatura 1°C y un rato minucioso del equilibrio 3 en cada temperatura de la medición.

Cuadro 3. trazos del Punto de fusión y valores de TM para una serie de proteínas en PBS.

El Sistema Nano de Malvern Zetasizer

El Zetasizer ZS Nano de los Instrumentos de Malvern es el primer instrumento comercial para incluir el soporte físico y el software para las mediciones dinámicas, estáticas, y electroforéticas combinadas de la dispersión luminosa, dando al investigador una amplia gama de propiedades de la muestra, incluyendo la talla, el peso molecular, y el potencial de la zeta. El sistema fue diseñado específicamente para cumplir los requisitos inferiores del volumen de la concentración y de muestra asociados típicamente a aplicaciones farmacéuticas y biomoleculares, junto con los requisitos de la alta concentración para las aplicaciones coloidales. La Satisfacción de esta mezcla única de requisitos era realizada vía la integración de un sistema óptico del retrodifusor y del diseño de un compartimiento nuevo de la célula. Como consecuencia de estas características, los pliegos de condiciones Nanos de Zetasizer ZS para el tamaño de muestra y la concentración exceden ésos para cualquier otro instrumento disponible en el comercio de DLS, con una gama de tallas de 0.6nm a 6um, y un rango de concentración de la lisozima 0.1mg/mL hasta el peso/volumen del 40%. Como beneficio añadido, la dotación física Nana de Zetasizer ZS es uno mismo que optimiza, y el software incluye una dimensión única de “un tecleo”, analiza, y señala la característica diseñada para disminuir la nueva curva de aprendizaje del utilizador.

Date Added: May 9, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:48

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