Selecção da Cristalização da Proteína Usando o Equipamento de Utilização Dinâmico da Dispersão de Luz dos Instrumentos de Malvern

Assuntos Cobertos

Fundo
     Crescimento de Cristais da Proteína
     O Segundo Coeficiente de Virial
     Medida do Segundo Coeficiente de Virial
     O Segundo Coeficiente de Virial e o Crescimento De Cristal Óptimo
Determinação Associada dos Problemas Do Segundo Coeficiente de Virial
     Dispersão de Luz Dinâmica
     Determinação Dinâmica da Dispersão de Luz e do Tamanho de Partícula
     Dispersão e Agregação Dinâmicas de Luz
Dispersão de Luz e Selecção Dinâmicas da Cristalização
EndoPG Mim Selecção
     Dispersão de Luz Dinâmica e EndoPG Mim Selecção
Sistema Nano de Zetasizer

Fundo

No começo dos 90, a dispersão de luz dinâmica (DLS) foi introduzida como uma ferramenta da selecção para o cristalografia. Ao longo da última década DLS tornou-se aceitado extensamente neste papel, e os instrumentos dinâmicos da dispersão de luz são integrados agora rotineiramente em laboratórios do cristalografia do Raio X. Um equívoco comum contudo, é que DLS pode dizer a um que amostras são prováveis render cristais. Na prática, DLS é usado mais apropriadamente como uma ferramenta para selecionar para fora as amostras que são pouco susceptíveis de render cristais. Neste artigo, nós endereçamos a diferença subtil nestes pontos, e examinamos o valor de técnicas da dispersão de luz como as ferramentas de cristal da selecção.

Crescimento de Cristais da Proteína

A taxa que determina a etapa na definição das estruturas de cristal está identificando as condições as melhores para o crescimento de cristal de alta qualidade. Há uma multidão de reagentes para gerar as “sopas” de que cristais de alta qualidade são crescidos. Contudo, todas as receitas tendem a ser específico da proteína, e quando alterar uma mistura favorita para serir um alvo novo da proteína for a aproximação padrão, a maior parte da vezes, a sorte joga um papel significativo na geração dos cristais de alta qualidade da proteína.

O Segundo Coeficiente de Virial

O segundo coeficiente virial (a)2 é uma propriedade termodinâmica que descreve a força da interacção entre a proteína e o solvente. Para sistemas do proteína-solvente com A2 > 0, a proteína “gosta do solvente” mais do que próprio e tende a ser solúvel. Quando A2 = 0, o solvente for descrito como um solvente da teta, indicando que a força da interacção do partícula-solvente é equivalente à força da interacção da partícula-partícula. Quando A2 << 0, a proteína “se gosta d” muito mais do que o solvente, e tende a agregar em amorfo precipita. Quando A2 é apenas ligeira negativo contudo, as circunstâncias são ideais para o crescimento de cristal da proteína em saturar concentrações (Figura 1).

Figura 1. taxa de êxito do crescimento De Cristal em função do ò coeficiente virial (a)2.

Medida do Segundo Coeficiente de Virial

O ò coeficiente virial é medido tipicamente usando técnicas estáticas da dispersão (SLS) de luz. A expressão de Rayleigh usada para descrever a dispersão da luz das partículas menores do que o comprimento de onda da luz de incidente é dada na Equação 1, onde K é uma constante óptica, C é a concentração da partícula, M é o peso molecular de média do peso, A2 é o ò coeficiente virial, e Rè é a relação de Rayleigh do dispersado à intensidade de luz do incidente.

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Como evidente na Equação 1, KC/Rè deve ser linear com concentração, com uma intercepção igual a 1/M e a uma inclinação que seja proporcional ao A.2

O Segundo Coeficiente de Virial e o Crescimento De Cristal Óptimo

O uso do ò coeficiente virial como um parâmetro da selecção para condições óptimas do crescimento de cristal era sugere primeiramente por Wilson e outros, que definiu o indicador da cristalização como -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10-4 (mol do mL/g)2. Este entalhe do indicador ou do cristal da cristalização é destacado como a zona II em Figura 2, que mostra os resultados estáticos da dispersão de luz para o lysozyme em concentrações diferentes de sal no amortecedor do ácido acético (pH 4).

Figura 2. lotes de Debye para o lysozyme em concentrações diferentes do NaCl no amortecedor do ácido acético no pH 4. O destaque cinzento na zona II, define o entalhe da cristalização, onde -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10.-4

Determinação Associada dos Problemas Do Segundo Coeficiente de Virial

Quando os crystallographers apreciarem o sucesso usando o indicador da cristalização para estabelecer condições da solução óptima, o número de medidas, e daqui o tempo exigido (para cima de 2 horas), avaliar A2 para um único solvente pode ser problemática, particularmente para aquelas que procuram uma aproximação alta da produção à selecção de cristal da proteína.

Dispersão de Luz Dinâmica

DLS é uma técnica que seja complementar à dispersão de luz estática, e pode ser executado em uma escala de tempo medida nas actas um pouco do que horas. Em DLS, dispersando a intensidade as flutuações são monitoradas através das escalas de tempo dos µs e correlacionadas então. As flutuações da intensidade são uma conseqüência do movimento da partícula, e a propriedade medida na análise de correlação é a distribuição de coeficientes de difusão. O tamanho é calculado então usando a equação de Avivar-Einstein (Eq. 2), onde o RH é o raio hidrodinâmico, k são a constante de Boltzmann, T está a uma temperatura, o ç é a viscosidade solvente e D é o coeficiente de difusão.

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Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 as zonas são aquelas detalhadas nos lotes de Debye mostrados em Figura 2, e as distribuições de tamanho são representante daquelas medidas para cada zona nas concentrações diluídas usadas para medidas estáticas e dinâmicas da dispersão de luz. Note que %Pd = (o ½ x 100 do Deslocamento Predeterminado da Polidispersidade).

Dispersão de Luz e Selecção Dinâmicas da Cristalização

Segundo as indicações de Figura 4, DLS pode ser usado para seleccionar 2 das 3 condições da solução que são pouco susceptíveis de conduzir ao crescimento de cristal de alta qualidade, isto é prova com as grandes impurezas e amostras com A <2 -8,0 x 10 mol-4 de mL/G. 2No general embora, DLS não pode distinguir amostras na zona Mim, onde a proteína é demasiado solúvel produzir cristais, daquelas dentro da zona II (entalhe da cristalização), onde as circunstâncias são óptimas para a geração de cristal de alta qualidade. Por outro lado, o crescimento de cristal é inerente um processo da agregação, e como tal, os pesquisadores estão sondando geralmente o limite entre zonas II e III, um pouco do que o limite entre zonas Mim e II. Assim quando DLS não puder ser os pesquisadores de prata da bala estava esperando que seria, ainda cumpre um papel importante em sua capacidade para seleccionar para fora as amostras que são pouco susceptíveis de produzir os cristais de alta qualidade.

EndoPG Mim Selecção

Um mecanismo comum para o rompimento de pilhas da planta por microbials patogénicos é a degradação enzimático da pectina na parede de pilha pelo EndoPG Mim, uma hidrolase microbiana glycosylated. Em estudos recentes, Kato podia e outros resolver as estruturas de cristal de três formulários do EndoPG Mim do purpureum de Stereum - EndoPG Ia, com as dois correntes do açúcar, EndoPG CI, com as quatro correntes do açúcar, e o De-EndoPG Ia, o formulário de-glycosylated do EndoPG Ia. Os pesquisadores eram incapazes de cristalizar um quarto formulário da enzima, EndoPG Ib, com as três correntes do açúcar pela proteína, e dificuldade relatada em obter cristais da qualidade para o formulário do EndoPG CI da enzima.

Dispersão de Luz Dinâmica e EndoPG Mim Selecção

O pre-cristal estuda para o EndoPG que Eu projecto caracterização incluída de DLS sob circunstâncias diluídas. Os resultados de DLS para o estudo são mostrados em Figura 5, que indica valores da polidispersidade de 7,4%, de 14,9%, e de 21,2% para os três formulários da proteína onde os cristais foram obtidos e 29,1% para o formulário que não produziu cristais. Estes resultados são consistentes com a regra empírica do Paládio de ~20% para a selecção de cristal de DLS.

Figura 5. resultados de DLS (Paládio = polidispersidade) da caracterização do pre-cristal dos quatro formulários do EndoPG Mim e fotos de cristal. obtido e 29,1% para o formulário que não produziu cristais. Estes resultados são consistentes com a regra empírica do Paládio de ~20% para a selecção de cristal de DLS.

Sistema Nano de Zetasizer

O sistema Nano de Zetasizer dos Instrumentos de Malvern é o primeiro instrumento comercial para incluir o hardware e o software para medidas dinâmicas, estáticas, e electrophoretic combinadas da dispersão de luz. A vasta gama de propriedades da amostra disponíveis para a medida com o sistema Nano de Zetasizer inclui, tamanho de partícula, peso molecular, e potencial do zeta.

O sistema Nano de Zetasizer foi projectado especificamente cumprir as baixas exigências do volume da concentração e de amostra associadas tipicamente com as aplicações farmacêuticas e biomoleculares, junto com as exigências da concentração alta para aplicações coloidais. Satisfazer esta mistura original de exigências era realizada através da integração de um sistema óptico do backscatter e do projecto de uma câmara nova da pilha. Em consequência destas características, as especificações Nano de Zetasizer para o tamanho da amostra e a concentração excedem distante aquelas para todo o outro instrumento dinâmico disponível no comércio da dispersão de luz.

Figura 6. sistema Nano de Zetasizer dos Instrumentos de Malvern.

Nota: Um grupo completo de referências pode ser obtido com referência ao original de fonte.

Source: “Dispersão de Luz Dinâmica - a Bala De Prata Para a Selecção De Cristal da Proteína? ”, Nota de Aplicação por Instrumentos de Malvern.

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos Ltd de Malvern (REINO UNIDO) ou Instrumentos de Malvern (EUA).

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:43

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