Onderzochte de Interactie van de Drug Gebruikend de AtoomMicroscopie van de Kracht met Uiteinden Functionalized van Bruker

Door AZoNano

De Lijst van het Onderwerp

Achtergrond
De Voorbereiding van de Steekproef
De Dynamische Spectroscopie die van de Kracht Uiteinden Vancmycin op Synthetische Steun Gebruiken
Het In Kaart Brengen van Losmakende Gebeurtenissen over het Leven Bacteriën
Conclusie
Erkenning

Achtergrond

De Huidige antibacteriële drugs zouden ondoeltreffende in de nabije toekomst toe te schrijven aan een fenomeen kunnen worden genoemd pharmacoresistance. Dit verwijst naar de capaciteit van micro-organismen om bacteriocidal (celmoord) of bacteriostatische die (remming van de groei) gevolgen te weerstaan door antibiotica worden veroorzaakt. De Bacteriën zijn gekend om drugweerstand door een evolutief proces te verwerven, dat door het algemene gebruik en het misbruik van antibiotica wordt aangestuurd. Als deze volksgezondheidsmoeilijkheid niet wordt overwonnen, ongeneeslijk kon een brede waaier van besmettelijke ziekten worden. De mechanismen van druggevolgen voor micro-organismen zijn tot op heden slecht begrepen. Vele vragen moeten nog worden beantwoord: waarom efficiënt houden de drugs op zijnd? Hoe kunnen wij betere degenen selecteren? Kunnen wij de ontwikkeling van drug bestand bacteriën vertragen?

Vancomycin is een glycopeptide antibiotisch acteren op Grampositieve bacteriën zoals stafylokokken, streptokokken en enterococci. Het bindt cally specifi aan eind D-Ala D-Ala van peptidoglycan voorlopers, verhinderend transglycosylation en transpeptidation, twee belangrijke stappen nodig voor peptidoglycan synthese, uiteindelijk leidend tot cellysis. De Atoom krachtmicroscopie heeft (AFM) reeds zijn voordelen op het gebied van farmacologie getoond, op voorwaarde dat relevante informatie over de manier de drugs met hun doelstellingen in wisselwerking staan. Deze techniek kan ook worden gebruikt om losmakende gebeurtenissen met pico-Newton krachtgevoeligheid tussen enige biomoleculen te meten.

In de huidige studie, vancomycinmodified uiteinden werden gebruikt om de krachten en de dynamica van de interactie te meten vancomycin/D-Ala. Deze metingen werden gemaakt op modelsubstraten evenals op het leven lactis Lactococcus bacteriën.

Figuur 1. Het Testen van bindende specificiteit van functionalized uiteinden AFM gebruikend modelsubstraten

De Voorbereiding van de Steekproef

De Bacteriën werden geoogst van exponentieel gekweekte culturen, opnieuw uitgesteld in buffer, en werden werden geïmmobiliseerd op poreuze polycarbonaatmembranen. AFM de beelden van de contactwijze en de forcedistancekrommen werden verkregen gebruikend een Bruker MultiMode AFM. De Metingen werden uitgevoerd gebruikend cantilevers van het het siliciumnitride van Bruker de driehoekig-gevormde. Voor krachtmetingen, werd de maximum toegepaste kracht gehouden bij 250 pN om inkeping te minimaliseren. Beelden van de Affiniteit werden verkregen door de krommeserie van de 16 x 16 krachtafstand te registreren, en de adhesiekracht voor elk over een bepaald gebied te berekenen. De de lenteconstanten van de cantilevers werden gevonden om ~0.011 N/m. te zijn.

Figuur 2. De de krachtspectroscopie van de enig-Molecule van de interactie vancomycin/D-Ala op synthetische steun. De Gouden uiteinden zijn functionalized met BIB (vancomycin) cysteamide terwijl de gouden die steunen met OEG en OEG propaanzuurdelen worden geëindigd covalent met peptides D-Ala worden gereageerd. (a) de Representatieve krachtkromme en de adhesiehistogram (n = 978) verkregen in buffer PBS tussen een vancomycin uiteinde en een steun D-Ala, met een hoge reproduceerbaarheid. (b) het experiment van de Controle bereikte met vrije peptides D-Ala die een dramatische daling van adhesiefrequentie tonen. (c) Perceel van de adhesiekracht als functie van het logaritme van het ladingstarief tijdens het intrekken, terwijl het houden van de interactietijd en de benaderingssnelheid (100 metingen voor elk gegevenspunt) constant. (d) Perceel van de adhesiefrequentie als functie van de interactietijd terwijl het houden van de benadering en de intrekkensnelheid (100 metingen voor elk gegevenspunt) constant.

Lijst 1. De chemische strategie wordt beschreven in Figuur 1 met een samenvatting van de experimentele dienovereenkomstig gemeten en geëxtrapoleerde gegevens

Experiment Bevestiging Resultaten
Van de de krachtafstand van de Opname de krommenFiguur 2A versus controleexperiment
Cijfer 2B
De Enige krachten van de moleculeadhesie 98 ± 33 pN (n=978)
De krachtkrommen van de Opname met variërende ladingstarieven
Cijfer 2C
De schaal van de Lengte van energiebarrière xB ~ 0.36 NM
  Kinetisch van-tarief constant van scheiding bij nul kracht Koff = 2x10-3 s-1
Variërende interactietijd terwijl het houden van de constante van het ladingstarief
Cijfer tweede
De tijd van de Interactie nodig voor helft-maximale waarschijnlijkheid van het binden t0.5 = 0.25s
  Het tariefconstante van de Vereniging
Kon = t0.5 -1NAVoff
Kon = 5 M-1 s-1
  De constante van het Evenwicht
KD = K/Koffon
Kd = 0.4 mm

 

De Dynamische Spectroscopie die van de Kracht Uiteinden Vancmycin op Synthetische Steun Gebruiken

De metingen van de de afstandskromme van de Kracht bevestigen de krachten van de enige en specific adhesie tussen vancomycin en D-Ala op synthetische steun. De dynamische de spectroscopiegegevens tonen een langzaam bindend proces. De evenwichtsscheiding constant van deze gebeurtenis werd gevonden om 0.4 mm te zijn, d.w.z. hoger dan in vorige studies. Dit kan door sterische belemmeringsgevolgen rond vancomycin en peptides worden verklaard D-Ala-DAla, die het erkenningsproces kunnen veranderen.

Het In Kaart Brengen van Losmakende Gebeurtenissen over het Leven Bacteriën

Zoals aangetoond in Figuur 3, vancomycin werden de uiteinden gebruikt om de distributie van enige peptides D-Ala op het leven lactis in kaart te brengen Lactococcus. Krommen van de Kracht werden geregistreerd tonend losmakende gebeurtenissen in ongeveer 12% van de gevallen. In tegenstelling tot vorige experimenten op een vlaksteun, openbaarde de histogram van de adhesiekracht (n = 1536) een bimodale distributie van adhesiekrachten met maxima bij 83 ± 22 pN en 150 ± 16 pN (Cijfer 3C). De eerste piek wordt verondersteld om op enige interactie te wijzen aangezien zijn waarde aan gevonden op de vlaksteun (~98 pN) dicht is. De andere piek kan op behulpzame band wijzen, die een bekend fenomeen voor vancomycin is. De specificiteit van deze interactie werd bewezen door het gebruik van een mutantbacterie producerend peptidoglycan voorlopers beëindigend door D-Ala-D-Lac in plaats van D-Ala.

Figuur 3. Weergave en het sonderen van plaatsen D-Ala op het leven bacteriën. (a) het beeld die van AFM één enkele die latics van gewichtsLactococcus in versaliacel tonen in een poreus die polymeermembraan vooral wordt opgesloten voor niet-invasieve en in situ weergave tijdens een afdelingsproces wordt aangepast. Het septumgebied evenals ring-like structuren worden verondersteld rijk om aan onlangs samengestelde peptidoglycan (witte doos) te zijn. (B, C) de cartografie van de Adhesie en de histogram van de adhesiekracht (n = 1536) met representatieve die krachtkrommen tussen vancomycin uiteinden en de het leven bacterie in het septumgebied worden geregistreerd. (D, E, F) Zelfde die experimenten op een mutantbacterie worden uitgevoerd die D-Ala-D-Lak einde die in plaats van D-Ala tentoonstellen, in een spectaculaire vermindering van de losmakende gebeurtenissen, zowel over de adhesieafbeelding als over de histogram resulteren.

Conclusie

De de krachtmetingen van de enig-Molecule AFM met antibiotisch-gewijzigde uiteinden laten de meting van antibiotische losmakende krachten en het in kaart brengen van hun het corresponderen ligands op levende bacteriën toe. De Relevante parameters kunnen uit de metingen worden gehaald van de krachtspectroscopie, die informatie over de specifistad en de dynamica van de drug-doel interactie verstrekken, die van grote hulp voor de ontwikkeling en de verbetering van nieuwe drugs kan zijn.

Erkenning

Dit werk werd gesteund door de Nationale Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek (FNRS), Université catholique DE Leuven (Fonds Spéciaux DE Recherche), Federaal Ce Offi voor Scientifi c, Technische en Culturele Zaken (Interuniversity Polen van het Programma van de Aantrekkelijkheid), en de Oostenrijkse Stichting van de Wetenschap (project p-15295). Het Werk in het laboratorium van J. Errington werd gefinancierd door een toelage van BBSRC. Wij danken L. Piraux voor het gebruik van de thermische evaporator, E. Ferain voor het gebruik van de aftastenelektronenmicroscoop. Y.F. Dufrêne en P. Hols zijn de Vennoten van het Onderzoek van FNRS. Gepubliceerd met toestemming van de Amerikaanse Chemische Maatschappij.

Deze informatie is afkomstig geweest, herzien en die van materialen door Bruker Nano Oppervlakten aangepast worden verstrekt.

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Nano Oppervlakten Bruker.

Date Added: Apr 2, 2008 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:07

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit