Interacções de Droga Investigadas Usando a Microscopia Atômica da Força com Pontas de Functionalized de Bruker

Por AZoNano

Lista do Assunto

Fundo
Preparação da Amostra
Espectroscopia Dinâmica da Força Usando Pontas de Vancmycin no Apoio Sintético
Traço Desatando Eventos nas Bactérias Vivas
Conclusão
Reconhecimentos

Fundo

As drogas anti-bacterianas Actuais puderam transformar-se em um futuro próximo ineficaz devido a um fenômeno chamado pharmacoresistance. Isto refere a capacidade dos micro-organismos para suportar (inibição de crescimento) os efeitos bacteriocidal (matança da pilha) ou bacteriostatic causados por antibióticos. As Bactérias são sabidas para adquirir a resistência de droga com um processo evolucionário, que seja conduzido pelo uso e pelo emprego errado difundidos dos antibióticos. Se este problema de saúde público não é superado, uma vasta gama de doenças infecciosas poderia tornar-se incurável. Os mecanismos de efeitos de droga em micro-organismos são compreendidos deficientemente até agora. Muitas perguntas permanecem ser respondidas: por que as drogas param de ser eficientes? Como podemos nós seleccionar melhor? Podemos nós retardar a revelação das bactérias resistentes aos medicamentos?

O Vancomycin é um antibiótico que actua no Relvado - bactérias positivas do glycopeptide tais como estafilococos, estreptococos e enterococus. Liga o specifi cally a D-Alá terminal D-Alá de precursores peptidoglycan, impedindo o transglycosylation e o transpeptidation, duas etapas principais necessários para a síntese peptidoglycan, eventualmente conduzindo ao cellysis. A microscopia Atômica da força (AFM) tem mostrado já suas vantagens no campo da farmacologia, fornecendo a informação relevante sobre a maneira que as drogas interagem com seus alvos. Esta técnica pode igualmente ser usada para medir desatar eventos com sensibilidade da força do pico-newton entre únicas biomoléculas.

No estudo actual, as pontas vancomycinmodified foram usadas para medir as forças e a dinâmica da interacção de vancomycin/D-Ala-D-Ala. Estas medidas foram feitas nas carcaças modelo assim como nas bactérias de vida da lactação de Lactococcus.

A Figura 1. especificidade obrigatória de Teste do AFM functionalized derruba usando as carcaças modelo

Preparação da Amostra

As Bactérias foram colhidas das culturas exponencial crescidas, resuspended no amortecedor, e imobilizadas nas membranas porosas do policarbonato. As curvas das imagens e do forcedistance do modo de contacto do AFM foram obtidas usando um Bruker AFM Multimodo. As Medidas foram executadas usando modilhões triangular-dados forma do nitreto de silicone de Bruker. Para medidas da força, a força aplicada máxima foi mantida em 250 pN para minimizar o recorte. As imagens da Afinidade foram obtidas gravando a disposição da curva da distância de 16 x 16 forças, e calculando a força da adesão para cada um sobre alguma área. As constantes da mola dos modilhões foram encontradas para ser ~0,011 N/m.

Figura 2. espectroscopia da força da Único-Molécula da interacção de vancomycin/D-Ala-D-Ala no apoio sintético. As pontas do Ouro functionalized com o cysteamide do bis (vancomycin) quando os apoios do ouro terminados com OEG e partes do ácido propionic de OEG são reagidos covalently com os peptides de D-Alá-D-Alá. (a) Curva Representativa da força e histograma da adesão (n = 978) obtido no amortecedor de PBS entre uma ponta do vancomycin e um apoio de D-Alá-D-Alá, com uma reprodutibilidade alta. (b) Experiência de Controle conseguida com os peptides livres de D-Alá-D-Alá que mostram uma diminuição dramática da freqüência da adesão. (c) Lote da força da adesão em função do logarítmo da taxa de carregamento durante a retração, ao manter-se constante o tempo de interacção e a ao velocidade de aproximação (100 medidas para cada ponto de dados). (d) Lote da freqüência da adesão em função do tempo de interacção ao manter constante a aproximação e a velocidade da retração (100 medidas para cada ponto de dados).

Tabela 1. A estratégia química é descrita em Figura 1 com um sumário dos dados experimentais medidos e extrapolados em conformidade

Experiência Validação Resultados
A distância da força da Gravação curva a Figura 2A contra a experiência de controle
Figura 2B
Únicas forças da adesão da molécula 98 ± 33 pN (n=978)
Curvas da força da Gravação com taxas de variação da carga
Figura 2C
Escala do Comprimento da barreira de energia ~B x 0,36 nanômetros
  Constante Cinética da fora-taxa da dissociação na força zero Koff = 2x10-3 s-1
Tempo de interacção de Variação ao manter a constante da taxa de carregamento
Figure o 2D
Tempo de Interacção necessário para a probabilidade metade-máxima da ligação t0.5 = 0.25s
  Constante da taxa da Associação
Kon = t0.5 -1NAVoff
Kon = 5 M-1 s-1
  Constante de Equilíbrio
KD = K/Koffon
Kd = 0,4 milímetros

 

Espectroscopia Dinâmica da Força Usando Pontas de Vancmycin no Apoio Sintético

As medidas da curva da distância da Força confirmam forças únicas e do specifi c da adesão entre o vancomycin e o D-Alá-D-Alá no apoio sintético. Os dados dinâmicos da espectroscopia mostram um processo obrigatório lento. A constante da dissociação do equilíbrio deste evento foi encontrada para ser 0,4 milímetros, isto é mais altamente do que em estudos precedentes. Isto pode ser explicado por efeitos steric do obstáculo em torno do vancomycin e dos peptides de D-Alá-DAla, que podem alterar o processo do reconhecimento.

Traço Desatando Eventos nas Bactérias Vivas

Segundo as indicações de Figura 3, as pontas do vancomycin foram usadas para traçar a distribuição de únicos peptides de D-Alá-D-Alá na lactação de vida de Lactococcus. As curvas da Força eram exibição gravada que desata eventos em aproximadamente 12% dos casos. Ao contrário das experiências precedentes em um apoio planar, o histograma da força da adesão (n = 1536) revelou uma distribuição bimodal de forças da adesão com máximos 83 no ± 22 pN e 150 o ± 16 pN (Figura 3C). O primeiro pico é pensado para reflectir únicas interacções desde que seu valor é próximo a esse encontrado no apoio planar (~98 pN). O outro pico pode reflectir o emperramento cooperativo, que é um fenômeno conhecido para o vancomycin. A especificidade desta interacção foi provada pelo uso de uma bactéria do mutante produzindo os precursores peptidoglycan que terminam pela D-Alá-D-Laca em vez de D-Alá-D-Alá.

Figura 3. Imagem Lactente e sondagem de locais de D-Alá-D-Alá nas bactérias vivas. (a) Imagem do AFM que mostra um único latics de Lactococcus do peso na pilha do versalia prendida em uma membrana porosa do polímero adaptada especialmente para a imagem lactente não invasora e in situ durante um processo da divisão. A área do septo assim como as estruturas em forma de anel são provavelmente ricas em peptidoglycan recentemente sintetizado (a caixa branca). (B, C) histograma da força da cartografia da Adesão e da adesão (n = 1536) com as curvas representativas da força gravadas entre pontas do vancomycin e a bactéria viva na área do septo. (D, E, F) as Mesmas experiências realizados em uma bactéria do mutante que exibe términos da D-Alá-D-Laca em vez de D-Alá-D-Alá, tendo por resultado uma redução espectacular dos eventos se desatando, na adesão que traça e no histograma.

Conclusão

as medidas da força do AFM da Único-Molécula com pontas antibiótico-alteradas permitem a medida do antibiótico que desata forças e traço de suas ligantes correspondentes nas bactérias vivas. Os parâmetros Relevantes podem ser extraídos das medidas da espectroscopia da força, fornecendo a informação sobre a cidade do specifi e a dinâmica da interacção do droga-alvo, que pode ser da grande ajuda para a revelação e a melhoria de drogas novas.

Reconhecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional para a Investigação Científica (FNRS), o catholique de Louvain de Université (Fonds Spéciaux de Pesquisa), o ce Federal de Offi para Scientifi c, os Casos Técnicos e Culturais (Pólos Interuniversity do Programa da Atracção), e a Fundação Austríaca da Ciência (projecto P-15295). O Trabalho no laboratório de J. Errington foi financiado por uma concessão do BBSRC. Nós agradecemos a L. Piraux para o uso do evaporador térmico, E. Ferain para o uso do microscópio de elétron da exploração. Y.F. Dufrêne e P. Hols são Investigadores Associados do FNRS. Publicado com permissão da Sociedade de Produto Químico Americano.

Esta informação foi originária, revista e adaptada dos materiais fornecidos por Superfícies Nano de Bruker.

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Superfícies Nano de Bruker.

Date Added: Apr 2, 2008 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:25

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