Utforskade DrogVäxelverkan genom Att Använda Atom- StyrkaMicroscopy med Functionalized Spetsar från Bruker

Vid AZoNano

Ämnet Listar

Bakgrund
Ta Prov Förberedelsen
Dynamisk StyrkaSpektroskopi genom Att Använda Vancmycin Spetsar på SyntetmaterialService
Kartlägga Unbinding Händelser på Bosatt Bakterier
Avslutning
Tack till personer

Bakgrund

Blir den antibacterial drogstyrkan för Ström ineffektiv i den near framtiden tack vare ett fenomen som kallas pharmacoresistancen. Detta ser till kapaciteten av microorganisms till den bacteriocidal motståndskraften (celldödandet), eller bacteriostatic (hämning av tillväxt) verkställer orsakadt vid antibiotikummar. Bakterier är bekant att få drogmotstånd till och med ett evolutions- bearbetar, som är drivande vid det utbredda bruket och missbruk av antibiotikummar. Om detta allmän hälsaproblem inte är betaget, kunde en lång räcka av smittsamma sjukdomar bli obotlig. Mekanismen av drogen verkställer på microorganisms förstås dåligt hitintills. Många ifrågasätter återstår att svaras: varför stoppar drogerna att vara effektiva? Hur kan vi välja bättre? Kan vi sakta besegrar utvecklingen av resistent bakterier för drogen?

Vancomycin är antibiotiskt agera för glycopeptide på Grammet - realitetbakterier liksom staphylococci, streptococci och enterococci. Den röraspecifien cally till den slutliga D-Alaen D-Alaen av peptidoglycan precursors och att förhindra transglycosylation och transpeptidation, två ha som huvudämne kliver nödvändigt för peptidoglycan syntes och slutligen att leda till cellysisen. Atom- styrkamicroscopy (AFM) har redan visat dess fördelar i sätta in av pharmacology som ger relevant information om drogerna, påverkar varandra långt med deras uppsätta som mål. Denna teknik kan också vara van vid mäter unbinding händelser med pico-newton styrkakänslighet mellan singelbiomolecules.

I den närvarande studien var vancomycinmodified spetsar van vid mäter styrkorna och dynamiken av vancomycin-/D-Ala-D-Alaväxelverkan. Dessa mätningar gjordes på modellerar substrates såväl som på att bo Lactococcus lactisbakterier.

Figurera 1. Testa bindande noggrannhet av functionalized använda för AFM-spetsar modellera substrates

Ta Prov Förberedelsen

Bakterier skördades från exponentially fullvuxna kulturer, resuspended in fungera som buffert, och immobilized på porösa polycarbonatemembran. AFM-kontaktfunktionsläget avbildar, och forcedistancen buktar erhölls genom att använda en Bruker MultiMode AFM. Mätningar utfördes genom att använda Brukers triangulär-formade cantilevers för silikonnitriden. För styrkamätningar hölls maximat applicerad styrka på 250 pN för att minimera inryckningen. Frändskap avbildar erhölls, genom att anteckna 16 x 16 som styrka distanserar buktar samling och beräkna adhesionstyrkan för varje över ett bestämt område. Fjädrakonstanterna av cantileversna fanns för att vara ~0,011 N/m.

Figurera 2. Singel-Molekyl styrkaspektroskopi av vancomycin-/D-Ala-D-Alaväxelverkan på syntetmaterialservice. Guld- spetsar functionalizeds med för cysteamidestunder för bis som (vancomycin) guld- service avslutas med OEG, och reageras propionic syrliga hälfter för OEG covalently med D-Ala-D-Alaen peptides. (A) Representativ styrka buktar, och adhesionhistogrammet (n = 978) erhållande i PBS fungera som buffert mellan en vancomycinspets och enAla service, med en kickreproducibility. (B) Kontrollera det uppnådda experiment med fri D-Ala-D-Ala peptidesvisning en dramatisk minskning av adhesionfrekvens. (C) Täppan av adhesionstyrkan som en fungera av logaritmen av ladda klassar under tillbakadragningen, stunden som håller konstant växelverkantiden, och att närma sig rusar (100 mätningar för varje data pekar). (D) Täppan av adhesionfrekvensen som en fungera av växelverkantidstunderna som håller konstant att närma sig och tillbakadragningen, rusar (100 mätningar för varje data pekar).

Bordlägga 1. Den kemiska strategin beskrivas in Figurerar 1 med ett summariskt av de experimentella datan som därmed mätas och extrapoleras

Experiment Godkännande Resultat
Anteckna styrka distansera buktar Figurerar 2A vs. kontrollerar experiment
Figurera 2B
Styrkor för Singelmolekyladhesion 98 ± 33 pN (n=978)
Anteckna styrka buktar med varierande laddar klassar
Figurera 2C
Längdfjäll av energibarriären ~B x 0,36 nm
  Kinetic av-klassa konstanten av dissociation på nollstyrka Koff = 2x10-3 s-1
Varierande växelverkantidstunder som håller ladda, klassar konstant
Figurera 2D
Växelverkantid som behövs för halva-maximal probability av bandet t0.5 = 0.25s
  Anslutningen klassar konstant
Kon = t0.5 -1NAVoff
Kon = 5 M-1 s-1
  Equilibriumkonstant
KD = K/Koffon
Kd = 0,4 en mm

 

Dynamisk StyrkaSpektroskopi genom Att Använda Vancmycin Spetsar på SyntetmaterialService

Styrka distanserar buktar mätningar bekräftar singel- och för specifi c adhesionstyrkor mellan vancomycin och D-Ala-D-Alaen på syntetmaterialservice. De dynamiska spektroskopidatan visar ett processaa långsamt band. Equilibriumdissociationkonstanten av denna händelse fanns för att vara 0,4 en mm, dvs. higher än i föregående studier. Detta kan förklaras av steric hindrar verkställer runt om vancomycin och D-Ala-DAla peptides, som kan förändra den processaa erkännanden.

Kartlägga Unbinding Händelser på Bosatt Bakterier

Som visat in Figurera 3, vancomycinspetsar var van vid kartlägger fördelningen av singelD-Ala-D-Alaen peptides på att bo Lactococcus lactis. Styrka buktar var antecknade unbinding händelser för visning i omkring 12% av fallen. Som motsatt till föregående experiment på en planar service, avslöjde adhesionstyrkahistogrammet (n = 1536) en bimodal fördelning av adhesionstyrkor med maxima på 83 ± 22 pN och 150 ± 16 pN (Figurera 3C). Det första maximalt tänks för att reflektera singelväxelverkan, sedan dess värdera är nästan den som finnas på den planar servicen (~98 pN). Det annat maximalt kan reflektera kooperativbandet, som är ett välkänt fenomen för vancomycin. Noggrannheten av denna växelverkan bevisades av bruket av en mutantbakterie producera peptidoglycan precursors som avslutar vid D-Ala-D-Gummilacka i stället för D-Ala-D-Alaen.

Figurera 3. Avbilda och sondera av D-Ala-D-Ala platser på bosatt bakterier. (A) AFM avbildar visning som en singelviktLactococcus latics i versaliacellen som fångades in i ett poröst polymermembran anpassade speciellt, för non-invasive och i situen som avbildar under en processaa uppdelning. Den septumområdet såväl som ringa-något liknande strukturerar tänks för att vara rika i nyligen synthesized peptidoglycan (vit boxas). (B, C) buktar Adhesioncartography och adhesionstyrkahistogrammet (n = 1536) med representativ styrka antecknat mellan vancomycinspetsar och den bosatt bakterien i septumområdet. (D, E, F) bar Samma experiment ut på en mutantbakterie som ställer ut D-Ala-D-Gummilacka ändelser i stället för D-Ala-D-Alaen och att resultera i en spektakulär förminskning av de unbinding händelserna, både på adhesionen som kartlägger och på histogrammet.

Avslutning

mätningar för Singel-Molekylen AFM-styrka med antibiotikum-ändrade spetsar möjliggör mätningen av unbinding styrkor för antibiotikummen och att kartlägga av deras motsvarande ligands på levande bakterier. Relevant parametrar kan dras ut från styrkaspektroskopimätningar som ger information om specifistaden och dynamiken av drog-uppsätta som mål växelverkan, som kan vara av stor hjälp för utvecklingen och förbättringen av nya droger.

Tack till personer

Detta arbete stöttades av MedborgareFundamentet för Vetenskaplig Forskning (FNRS), den Université catholiquen de Louvain (Fonds Spéciaux de Recherche), den Federala Offi cen för Scientifi c, Tekniska och Kulturella Angelägenheter (Interuniversity Poles av Dragningen Programmerar) och det Österrikiska VetenskapsFundamentet (projektera P-15295). Arbete i laboratoriumet av J. Errington betalades av ett lån från BBSRCEN. Vi tackar L. Piraux för bruket av den termiska luftfuktaren, E. Ferain för bruket av scanningelektronmikroskopet. Y.F. Dufrêne och P. Hols är Research Associates av FNRSEN. Publicerat med tillåtelse av det Kemiska Samhället för Amerikan.

Denna information har varit sourced, granskat, och anpassat från material förutsatt att av Nano Bruker Ytbehandlar.

För mer information på denna källa behaga besök Nano Bruker Ytbehandlar.

Date Added: Apr 2, 2008 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:31

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit