Studio dell'Interazione Fra Dopamina e D1-Receptor in Celle di SH-SY5Y facendo uso di Microscopia Atomica della Forza

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Introduzione
Preparato del Campione
Facendo Uso del AFM Per Tenere La Carreggiata Dopamina che Binging ai Ricevitori Diretti a membrana D1
Risultati
Conclusione

Introduzione

Oltre alle sue capacità di alta risoluzione della rappresentazione, la microscopia atomica della forza (AFM) è emerso come strumento potente per la misurazione sia i beni nanomechanical che delle forze di interazione dei complessi biomolecolari. Mentre la maggior parte di questi tipi di studi del AFM è stata condotta sulle molecole isolate, dato che sulla vera pertinenza biologica queste indagini dovrebbero essere condotte idealmente sui sistemi in tensione delle cellule.

Inoltre, ora sembra essenziale per potere da coppia il AFM con altre tecniche come microscopia ottica per raccogliere simultaneamente entrambi i tipi di dati. Finora, molto pochi studi sono basati sulla combinazione di AFM e di microscopia ottica invertita.

Nello studio presente abbiamo studiato l'applicazione potenziale delle misure della forza nel video la risposta e dei beni obbligatori del ricevitore della dopamina D1 sopra stimolo con dopamina. Abbiamo usato un sistema completamente integrato di epifluorescence e del AFM per correlare le misure della rappresentazione della fluorescenza e della forza del AFM.

La Dopamina (DA, 4 (2-aminoethyl) benzene-1,2-diol) è un neurotrasmettitore importante che appartiene alla famiglia della catecolammina, in base ad un amminoacido aromatico chiamato tirosina ed è il precursore di due ormoni principali: adrenalina e noradrenalin.

Nel sistema nervoso periferico, il ruolo principale di dopamina è di modulare le funzioni cardiovascolari come un analeptic, un volume d'affari dell'ormone, una funzione renale, un flusso vascolare e motilità gastrointestinale. Nel sistema nervoso centrale (CNS), la dopamina è compresa nel controllo delle funzioni, della cognizione, dell'emozione, dell'ingestione di cibo e del regolamento locomotori della ghiandola endocrina. La Disfunzione della neurotrasmissione dopaminergica nello SNC è collegata a vari disordini neuropsichiatrici, compreso la sindrome di Tourette, la Malattia del Parkinson, la schizofrenia, la paranoia e disordine dell'iperattività di deficit di Attenzione (ADHD). I ricevitori della Dopamina sono classificati da D1 a D5 di cui i ricevitori D1 e D2 compongono la più grande proporzione. Per il trattamento di queste malattie l'identificazione delle droghe dopaminergiche prive degli effetti secondari è una di più grandi sfide nella ricerca e nella scoperta di un neurone della droga.

In questo studio particolare, abbiamo utilizzato un ricevitore YFP-contrassegnato del transmembrane D1 per studiare la città di specifi dell'interazione fra questo ricevitore e un suggerimento del AFM dell'ed della dopamina-modifi, facendo uso sia della spettroscopia della forza che delle funzionalità ottiche della rappresentazione del nostro strumento integrato.

Preparato del Campione

Le celle di SH-SY5Y transfected con il ricevitore YFP-etichettato della Dopamina D1 (DRD1-EYFP). La Transfezione è stata eseguita dal nucleofection (Nucelofector, AMAXA) facendo uso di una sospensione delle cellule (106 cells/ml), di un DNA di 4 plasmidi del µg e del buffer di transfezione di 100 µl (AMAXA). Successivamente, le celle sono state seminate sui contratti provvisori sterili del coperchio (18x18 millimetro) in 6 zolle buone. 48 h dopo le celle aderenti di transfezione che esprimono il DRD1-EYFP sono stati stimolati con il cloridrato della Dopamina del µM 10-50.

Le immagini (BF) di Brightfield, di DIC e di epifluorescence si sono acquistate su un microscopio invertito dell'Osservatore di Zeiss Axio fornito di una macchina fotografica di AxioCam MRC e del software di AxioVision. Tutte Le immagini del AFM sono state registrate su un AFM che completamente è stato integrato con il microscopio ottico, facendo uso delle travi a mensola di DNP/MSCT.

Tutti Gli esperimenti sono stati eseguiti in contatto e TappingMode™ facendo uso del buffer di PBS e delle travi a mensola MSCT tipe e di DNP- più molli (costante nominale 0,06 N/m e 0.01N/m della sorgente, rispettivamente.). Le travi a mensola di Dopaminefunctionalized sono state preparate come precedentemente descritte.

Brevemente, un derivato (PEG) del polietileneglicole, avendo un'estremità amminico-reattiva e un'estremità tiolo-reattiva, è stato usato come linker e come molecola lling inerte retro-fi in modo che soltanto la dopamina potesse contribuire alle interazioni obbligatorie osservate. Le costanti della Sorgente sono state calcolate in liquido su un supporto rigido (fondo di vetro della capsula di Petri) E le sensibilità di deformazione sono state aggiornate manualmente nel software. Complessivamente curve di 3072 forze erano il modo in vigore registrato del volume, alla tariffa di scansione fra 3 e 3,5 Hertz e con una mora di ritiro di Spettrografia di massa 10. L'area di scansione era µm 2x2.

Facendo Uso del AFM Per Tenere La Carreggiata Dopamina che Binging ai Ricevitori Diretti a membrana D1

I ricevitori YFP-etichettati overexpressed D1 localizzano pricipalmente nella membrana di plasma e mostrano una distribuzione casuale in celle di un neurone di SH-SY5Y. Sulla Base dei dati della fluorescenza i ricevitori interiorizzano nel citoplasma sopra stimolo con dopamina. Per supportare questa ipotesi e per verificare l'applicazione potenziale del AFM, abbiamo tenuto la carreggiata l'associazione del DA ai ricevitori diretti a membrana D1 ed alla loro interiorizzazione successiva.

In Primo Luogo, le travi a mensola di DNP functionalized con un analogo della dopamina come illustrato in Figura 1. Al punto seguente le celle in tensione sono state esposte a parecchie concentrazioni del DA da 10 a µM 50 per stimolare i ricevitori della membrana D1.

Figura 1. interazioni di Studio del legante-ricevitore su una cella vivente. Il suggerimento del AFM functionalized in tal modo che le parti chimiche di dopamina (DA) in questione nell'interazione con il suo D1-receptor sono conservate. Inoltre, la lunghezza del distanziatore minimizza l'effetto del suggerimento sull'interazione stesso.

Sia le immagini di epifluorescence che i film del timelapse sono stati registrati per individuare i cambiamenti nel segnale fluorescente di distribuzione del ricevitore D1 e conseguentemente, studiare l'interiorizzazione ed i beni obbligatori della dopamina YFP-etichettata D1-receptor.

La Figura 2A mostra l'esperimento alla t0: attualmente punto, la dopamina non si è applicata e così, i ricevitori D1 non sono stimolati. Di conseguenza, i ricevitori YFP-etichettati D1 rimangono diretti a membrana rivelando una macchiatura fluorescente omogenea attraverso la superficie delle cellule. Un cambiamento significativo nella distribuzione fluorescente è raggiunto sopra stimolo del D1-receptor dal DA. La Figura 2B mostra un esempio tipico delle immagini registrate al T.10min Per tutte le concentrazioni del DA, nessun uorescence di Florida della membrana è stato individuato dopo un'incubazione di 10 minuti.

La Figura 2. la rappresentazione di Correlazione della fluorescenza ed AFM forza le misure. Il suggerimento del AFM è stato etichettato con un analogo del DA per seguire la posizione di D1-receptors YFP-etichettato prima e dopo l'applicazione del DA libero. Prima di stimolo dal DA, i ricevitori sono cella diretta a membrana e così, la fluorescenza si distribuisce da ogni parte della superficie delle cellule (A) e le curve della forza esibiscono un'alta percentuale degli eventi scioglienti specifici (C). 10 minuti dopo l'applicazione del DA, tutta la fluorescenza è concentrata nei piccoli punti (non ci sono B) ed eventi di specifi c volume in vigore registrato che prova che tutti i ricevitori sono stati interiorizzati nel cytosol.

Invece, le piccole vescicole fluorescenti intracellulari multiple variabili nella dimensione e nella luminosità sono state osservate indicare l'interiorizzazione possibile del ricevitore (Figura 2B). Punti di Questa osservazione ad un'associazione attiva del legante DA al ricevitore D1 nella cella di SH-SY5Y modellano. Si Noti che la fluorescenza debole segnala richiesto noi per usare i molti tempi dell'esposizione di ottenere le immagini della fluorescenza. Per evitare l'imbianchimento possibile ci effettua chiusi l'otturatore della fluorescenza durante l'applicazione del DA ed aperta appena prima l'acquisto dell'immagine.

Oltre a rappresentazione di fluorescenza, il DA - le forze scioglienti di D1-receptor sono state registrate facendo uso del modo del volume della forza del AFM sulle celle viventi ai punti differenti di tempo in presenza ed assenza di dopamina. La rappresentazione del volume della Forza di un unicellulare con un suggerimento DA-functionalized al punto la t (0 nessuno stimolo di tempo di D1-receptors) ha provocato una parte della sopraelevazione ferroviaria di signifi (13,12%) di curve della forza che esibiscono un evento sciogliente specifico (Figura 2C).

Parallelamente alle osservazioni ottiche, le misure della forza egualmente sono state realizzate al punto t di tempo10min (dopo stimolo di D1-receptors dal DA). Secondo le indicazioni della Figura 2D, tutte le curve registrate della forza hanno esibito l'evento sciogliente non specifico, così supportando le nostre osservazioni dalla rappresentazione della fluorescenza dell'interiorizzazione del D1-receptors nel cytosol. Non abbiamo trovato questo fenomeno per essere reversibili anche dopo 1 ora di stimolo del DA. Il Confronto delle immagini e dei film di ripresa temporizzata ha confermato che il cambiamento osservato del reticolo della fluorescenza è una conseguenza diretta del trattamento di interiorizzazione.

Risultati

Nei nostri studi, il DA - le interazioni del Di-ricevitore hanno esibito una singola forza sciogliente concentrata intorno 223 a ± 82 PN. Interessante, il valore di picco era stabile una volta misurato alla barriera della cella, mentre le più forti variazioni e gli più alti valori sono stati osservati per le misure catturate vicino al nucleo delle cellule. Fin qui, il meccanismo di interazione fra dopamina ed il suo ricevitore completamente non è capito. Gli Studi riferiscono le caratteristiche farmaceutiche di dopamina come pure molte dei sui agonisti ed antagonisti, ai sui ricevitori potenziali. Secondo il tipo del ricevitore, le costanti di dissociazione sono state trovate per essere fra 880 e 2980 nanometro.

La spettroscopia Dinamica della forza può anche essere usata per la determinazione dei parametri cinetici. Nella nostra impostazione di lavoro, tutte le scansioni del AFM sono state eseguite nelle stesse circostanze, ma è egualmente possibile variare i parametri di scansione e tracciare la forza sciogliente in funzione del tasso di carico. La progressione della Curva può fornire informazioni se la cinetica del trattamento sciogliente dipende dalla barriera interna o esterna del paesaggio di energia. La costante cinetica di fuori rate (k)off di dissociazione può anche essere risoluta.

Da essenzialmente, tracciando la forza di aderenza in funzione del logaritmo del tasso di carico durante la ritrazione, mentre tenere costante il tempo di interazione e la velocità di avvicinamento, riveleranno il disgaggio di lunghezza della barriera di energia. Extraoplation della curva a forza zero darà il K.off

d'altra parte, tracciare la frequenza di aderenza in funzione del tempo di interazione mentre tiene costante l'approccio e la velocità di ritrazione darà il momento di interazione necessario per la probabilità mezzo massima dell'associazione. Per Concludere, conoscendo la costante di tariffa di associazione (k)on, la costante di equilibrio può essere determinata come segue: KD = K/Koffon.

Conclusione

La ricerca attuale dimostra il potenziale di microscopia combinata di fluorescenza e del AFM di studiare la presenza ed i beni obbligatori di dopamina D1-receptors sulla superficie delle celle in tensione. in questa serie in due parti di Note di Applicazione sull'uso del AFM nello studio sulle malattie neurodegenerative (Vedi AN117: Parte I) gli esperimenti messi a fuoco sull'integrazione di due tecniche importanti utilizzate nelle applicazioni di scienze biologiche. Combinando le tecniche ottiche di microscopia con il AFM concede:

  1. identificazione 3D delle molecole di interesse il BF, DIC, fluorescenza e dalle immagini di altezza del AFM.
  2. Indagine sulle proprietà fisiche della molecola dell'obiettivo con rappresentazione ottica e dati topografici, di attrito, viscoelastici e di aderenza.
  3. osservazione in tempo reale di un evento cellulare di segnalazione al disgaggio di submicron.
  4. Misura della forza sciogliente specifica fra un legante ed il suo ricevitore ed in misura ulteriore, determinazione dei loro parametri cinetici. Questa ultima opzione apre le possibilità enormi nel campo di farmacologia, particolarmente scoperta della droga.

Combinando la microscopia ottica con il AFM, questo non solo fornisce agli utenti i vantaggi di entrambe le tecniche in un singolo esperimento, egualmente offre l'accesso facile al campione e un'alta flessibilità di manipolazione. Crediamo che questi studi forniscano i risultati in modo convincente quanto al valore di tale strumentazione multimodale e contribuiscano ad accelerare gli avanzamenti nella ricerca nella neurologia.

Questi informazioni sono state originarie, esaminate ed adattate dai materiali forniti dalle Superfici Nane di Bruker.

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego le Superfici Nane di Bruker.

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:14

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