原子力の顕微鏡検査を使用して SH-SY5Y のセルのドーパミンと D1 受容器間の相互作用の調査

カバーされるトピック

導入
サンプル準備
膜行きの D1 受容器に好きなだけ楽しむドーパミンを追跡する AFM を使用して
結果
結論

導入

高リゾリューションイメージ投射機能に加えて、原子力の顕微鏡検査は (AFM) biomolecular 複合体の nanomechanical 特性そして相互作用力を両方測定するための強力なツールとして現れました。 これらのタイプの AFM の調査の大半が隔離された分子、なぜなら本当の生物的検索能力で行なわれる間、これらの調査は生きているセルシステムで理想的に行なわれるべきです。

さらに、今同時に両タイプのデータを集めるために光学顕微鏡検査のような他の技術の AFM をつなげます必要なようです。 これまでは、非常に少数の調査は AFM および逆にされた光学顕微鏡検査の組合せに基づいています。

現在の調査で私達はドーパミンとの刺激にドーパミン D1 の受容器の応答そして結合特性の監視の力の測定の潜在的なアプリケーションを調査しました。 私達は蛍光性イメージ投射および AFM 力の測定を関連させるのに十分に統合された AFM および epifluorescence システムを使用しました。

ドーパミンは (DA の 4 (2 aminoethyl の) ベンゼン 1,2 グリコール) チロシンと呼出される芳香のアミノ酸に基づいてカテコラミングループに、属する主要な神経伝達物質で 2 つの主要なホルモンの前駆物質です: アドレナリンおよび noradrenalin。

末梢神経系では、ドーパミンの主要な役割は強壮剤、ホルモンの転換、腎臓機能、管の流れおよび胃腸運動性として心血管機能を調整することです。 中枢神経系では (CNS)、ドーパミンは locomotor 機能、認知、感情、滋養分および内分泌の規則の制御にかかわります。 CNS の dopaminergic neurotransmission の機能障害は Tourette のシンドローム、パーキンソン病、精神分裂症、パラノイアおよび注意欠陥のを含むいろいろ神経精神病学の無秩序に、活発性過度の無秩序 (ADHD) リンクされます。 ドーパミンの受容器は D1 から D1 および D2 受容器が最も大きい割合を構成する D5 への分類されます。 これらの病気の処置のために副作用に欠けている dopaminergic 薬剤の識別は神経の研究および薬剤の発見の大きな挑戦の 1 つです。

この特定の調査では、私達は私達の統合されたツールの力の分光学そして光学イメージ投射機能両方を使用してこの受容器とドーパミンmodifi ED AFM 先端間の相互作用の specifi 都市を、調査するのに YFP 分類された transmembrane D1 の受容器を使用しました。

サンプル準備

SH-SY5Y のセルは YFP 付けられたドーパミン D1 の受容器 (DRD1-EYFP) によって transfected。 トランスフェクションは nucleofection (Nucelofector、 AMAXA) によってセル中断 (10 cells/ml)、6 4 個の µg のプラスミッド DNA および 100 つの µl のトランスフェクションバッファ (AMAXA) を使用して行われました。 続いて、セルは 6-well 版の生殖不能カバースリップ (18x18 mm) でシードされました。 DRD1-EYFP を表現する 10-50 µM のドーパミンの塩酸塩とトランスフェクションの付着性のセルの後の 48 h は刺激されました。

Brightfield (BF)、 DIC および epifluorescence の画像は AxioCam MRC のカメラおよび AxioVision のソフトウェアが装備されているツァイス Axio の観測者の逆にされた顕微鏡で得られました。 すべての AFM の画像は光学顕微鏡によって十分に統合された AFM に DNP/MSCT の片持梁を使用して記録されました。

すべての実験は PBS バッファおよび最も柔らかい DNP- および MSCT タイプの片持梁 (わずかなばねの定数 0.06 N/m および 0.01N/m、それぞれ。) を使用して接触および TappingMode™で行われました。 Dopaminefunctionalized の片持梁は前に記述されているように準備されました。

端的に説明すると、ポリエチレングリコールの (PEG)派生物は、アミノ反応端およびチオール反応端を持っていて、リンカと不活性バック fi lling 分子としてドーパミンだけ観察された結合の相互作用に貢献できるのは使用されたからです。 ばねの定数は堅いサポート (ペトリ皿のガラス底) の液体で計算され、偏向感度はソフトウェアで手動でアップデートされました。 3072 の力のカーブの合計は力ボリュームモードに、 3 つそして 3.5 Hz 間のスキャンレートに、そして 10 氏の引き込めの遅延と記録されました。 スキャン領域は 2x2 µm でした。

膜行きの D1 受容器に好きなだけ楽しむドーパミンを追跡する AFM を使用して

overexpressed YFP 付けられた D1 受容器は血しょう膜に主に集中し、神経 SH-SY5Y のセルで任意分布を示します。 蛍光性データに基づいて受容器はドーパミンとの刺激に細胞質に内面化します。 この仮説をサポートし、 AFM の潜在的なアプリケーションをテストするために、私達は膜行きの D1 受容器およびそれに続く内面化に DA の結合を追跡しました。

最初に、 DNP の片持梁は図 1. に示すようにドーパミンのアナログと functionalized。 D1 膜の受容器を刺激するために次のステップで生きているセルは 10 からの 50 µM への複数の DA の集中 -- にさらされました。

生体細胞の図 1. 調査の配位子受容器の相互作用。 AFM の先端は D1 受容器によって相互作用にかかわる (DA)ドーパミンの化学一部分が維持されるように functionalized。 さらに、スペーサの長さは相互作用に対する先端の効果自体を最小化します。

従って D1 受容器の分布の蛍光シグナルの変更を検出するために YFP 付けられたドーパミンの D1 受容器の内面化そして結合特性を調査する epifluorescence の両方画像および timelapse 映画はおよび、記録されました。

図 2A は t で実験を示します0: ポイント現時点で、ドーパミンは加えられないし、こうして、 D1 受容器は刺激されません。 その結果、 YFP 付けられた D1 受容器は膜行きに残りまセル表面を渡って同質な蛍光汚損を明らかにします。 蛍光分布の重要な変更は DA によって D1 受容器の刺激に達成されます。 図 2B は T. に記録される画像の典型的な例を示します。10min すべての DA の集中のために、膜 fl の uorescence は 10 分の孵化の後で検出されませんでした。

図 2. 関連の蛍光性イメージ投射および AFM は測定を強制します。 AFM の先端は DA のアナログと自由な DA を加える前後に YFP 付けられた D1 受容器の位置に続くために付きました。 DA による刺激の前に、受容器は膜行きのセルこうしてであり、蛍光性はセル表面 (a) をくまなく配られ、力のカーブは特定のアンバインドのイベント (c) の高いパーセントを表わします。 DA アプリケーションの後の 10 分、すべての蛍光性は小さい点 (b) に集中され、 specifi c のイベントはすべての受容器が cytosol に内面化されたと証明する力ボリュームに記録されません。

その代り、多重小さい細胞内の蛍光小胞の変数および明るさは可能な受容器の内面化 (図 2B) を明記することを観察されました。 SH-SY5Y のセルの D1 受容器への配位子 DA の実行中の結合へのこの観測点は模倣します。 弱い蛍光性が必須蛍光性の画像を得る長い露光時間を使用する私達に信号を送ることに注目して下さい。 可能な bleaching を避けることは DA のアプリケーションの間に私達を閉じ、蛍光性シャッターを開きました画像を得る直前のもたらします。

蛍光性イメージ投射に加えて、 DA - D1 受容器のアンバインド力はドーパミンの存在そして不在の異なった時間ポイントの生体細胞の AFM 力ボリュームモードを使用して記録されました。 時間ポイント t (D1 受容器の刺激無し) の DAfunctionalized 先端の0 単一セルの力ボリュームイメージ投射は特定のアンバインドのイベント (図 2C) を表わす力のカーブの signifi の傾斜の部分 (13.12%) で起因しました。

並行して光学観察に、力の測定はまた時間ポイント t で行われました10min (DA による D1 受容器の刺激の後で)。 従って図第 2 に示すように、すべての記録された力のカーブは特定のアンバインドのイベントを表わし、 cytosol に D1 受容器の内面化の蛍光性イメージ投射によって私達の観察をサポートします。 私達は DA の刺激の 1 時間の後でさえも可逆であるとこの現象が見つけませんでした。 画像およびタイム経過映画の比較は蛍光性パターンの観察された変更が内面化プロセスの直接結果であることを確認しました。

結果

私達の調査では、 DA - ディディミアム受容器の相互作用は 223 ± のまわりに 82 pN 集中した単一のアンバインド力を表わしました。 興味深いことに、中間のピーク値は最も強い変化および高い値が細胞核の近くで取られた測定のために観察された一方セルの端で測定されたとき安定していました。 今まで、ドーパミンと受容器間の相互作用のメカニズムは十分に理解されません。 調査は潜在的な受容器にドーパミンの薬剤の特性、またアゴニストおよび反対者の多数を、報告します。 受容器のタイプによって、分離の定数は 880 と 2980 nM の間にあると見つけられました。

ダイナミックな力の分光学はまた運動パラメータの決定に使用することができます。 私達の働くセットアップでは、すべての AFM スキャンは同じ条件の下で行われましたが、スキャンパラメータを変え、ローディングレートの機能としてアンバインド力を計画することもまた可能です。 カーブの進行はアンバインドプロセスの動力学がエネルギー景色の内部か外の障壁により依存していればかどうかについて情報を提供できます。 分離の運動以外レートのoff定数 (k) はまた断固としたである場合もあります。

本質的にによって、付着力を、が一定した対話単位時間保存およびアプローチ速度は引き込みの間にローディングレートのロガリズムの機能として計画して、エネルギー障壁の長さのスケールを明らかにします。 力ゼロのカーブの Extraoplation は K. を与えます。off

一方では一定したアプローチおよび引き込みの速度を保っている間、対話単位時間の機能として付着の頻度を計画することは必要な不良部分の半極大確率のための対話単位時間を与えます。 最後に、連合のレートの定数 (k) を知っていてon、平衡定数は次の通り定めることができます: KD = K/Koffon.

結論

現在の調査は結合された AFM および蛍光顕微鏡の潜在性を生きているセルの表面のドーパミンの D1 受容器の存在そして結合特性を調査する示します。 この 2 部の一連の neurodegenerative 病気の調査の AFM の使用のアプリケーションノート (AN117 を見て下さい: I) 生命科学アプリケーションで使用される 2 つの主要な技術の統合に焦点を合わせる実験を部品。 AFM と光学顕微鏡検査の技術を結合することは割り当てます:

  1. BF、 DIC、蛍光性および AFM の高さの画像による興味の分子の 3D 識別。
  2. 光学イメージ投射および地勢、摩擦、粘弾性がある、および付着データによるターゲット分子の物理的性質の調査。
  3. ミクロ以下のスケールの細胞シグナリングイベントのリアルタイムの観察。
  4. 配位子と受容器間の、そしてそれ以上の範囲への特定のアンバインド力の測定、運動パラメータの決定。 この最後のオプションは薬理学、特に薬剤の発見のフィールドの巨大な可能性を開きます。

AFM と光学顕微鏡検査を結合することによって、これは単一の実験の両方の技術の利点をしかユーザーに与えません、またサンプルへの容易なアクセスおよび処理の高い柔軟性を提供します。 私達はこれらの調査がそのような multimodal 器械使用の値に関して説得力をこめて結果を提供し、神経学の研究の前進の促進を助けることを信じます。

この情報は Bruker の Nano 表面によって提供される材料から供給され、見直され、そして適応させて。

このソースのより多くの情報のために Bruker の Nano 表面を訪問して下さい。

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:15

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit