Relacionamentos da Actividade da Conformação: Por Que as Moléculas Deformam?

Dr. Gerry Ronan, CEO, Grupo Em Campo Afastado Ltd.
Autor Correspondente: gronan@farfield-group.com

Fundo

A Bioquímica é caracterizada por fraco, não covalent, ligações entre os grandes biopolymers que continuamente são feitos e quebrados em forças de variação da reacção. As forças da interacção, typified pelo tipo forças de camionete der Waal podem variar pela distância da interacção à potência de 6 e conseqüentemente a capacidade de uma molécula a “coube” ou conformou-se à forma de uma dobra ou o bolso em outra conduz a reacção.

Inversamente, um sócio obrigatório pode distorcer a conformação de uma biomolécula (por exemplo uma proteína) para permitir ou desabilitar uma actividade bioquímica potencial que regula desse modo a reacção. Certamente, este é os locais básicos atrás da intervenção farmacêutica onde as moléculas pequenas são projectadas para que sua capacidade interaja e distorça selectivamente a conformação de uma proteína do alvo implicada em um mecanismo da doença.

A Interferometria da Duplo-Polarização (DPI) mede a conformação de uma proteína medindo seu diâmetro (ou tamanho) e a densidade (isto é, sua massa pelo volume de unidade ou como dobrado firmemente lhe é) acoplando a proteína a uma placa de vidro e sondando usando o sistema ótico não-diffractive. O método resolve a conformação da proteína às dimensões subatômicos (bem abaixo de 0,1 Å) no tempo real e tem uma aceitação crescente entre pesquisadores no campo da caracterização da proteína, uma disciplina essencial na ciência do proteomics.

Em Em Campo Afastado, nosso trabalho ao longo da última década revolveu em torno da medida directa da forma ou da conformação das biomoléculas e como este muda enquanto as biomoléculas funcionam. Esta capacidade para monitorar o Relacionamento da Actividade da Conformação (CAR) é manifestada em uma ferramenta analítica do benchtop conhecida como um Interferómetro Duplo da Polarização1 que meça o tamanho e a densidade moleculars da dobra (e se reuna conseqüentemente) das biomoléculas de interacção capturadas em uma placa de vidro. A técnica tem a definição do picometer, é tempo real e etiqueta livre e já tem um userbase crescente através de 19 países no mundo inteiro.

A Importância de Relacionamentos da Actividade da Conformação (CAR)

Por exemplo no projecto farmacêutico, uma vontade convencional do programa de selecção da droga selecciona candidatos de uma biblioteca de muito mil se não milhões com base em sua capacidade para colar selectivamente ao alvo da proteína (como implicado no mecanismo da doença), referida como a afinidade da interacção. Uma interacção alta da afinidade pode ocorrer em concentrações muito baixas do candidato e conseqüentemente o candidato é menos provável induzir em outra parte efeitos secundários. Contudo, a afinidade alta não dá nenhuma segurança que o candidato se está conformando a biomolécula correctamente ou de todo. Não seria melhor ter uma molécula mais baixa da afinidade, induzindo a conformação correcta para a actividade desejada que poderia então ser aperfeiçoada (pela engenharia molecular) para aumentar sua afinidade?

Um exemplo simples é mostrado abaixo onde uma proteína do alvo (proteína do prião como implicada no nvCJD) é desafiada por concentrações diferentes de um número de íons do metal. Da massa do íon do metal associada em cada concentração a afinidade (e a estequiometria) podem ser medidas. Porém dos perfis um do tamanho e da densidade pode ver imediatamente que o cobalto não distorce a molécula quando o zinco, que tem uma afinidade similar, faz.

Além Disso, a mudança conformational evidente no caso do cobre (uma consolidação mostrada como uma diminuição no tamanho da proteína e um aumento em sua densidade) não inverte inteiramente (isto é lançou em uma conformação ou em um isoform estável diferente) visto que a mudança conformational com zinco inverte inteiramente. Três Relacionamentos diferentes da Actividade da Conformação de três interacções com afinidade similar.

Figura 1. Exemplos de Relacionamentos diferentes da Actividade da Conformação para interacções obrigatórias da afinidade similar dos íons do metal que ligam à proteína do prião (PrP). São Mostrados a massa da associação e da dissociação de íons diferentes do metal nas concentrações diferentes (de quais a afinidade da interacção pode ser calculada) e os perfis correspondentes do tamanho e da densidade (de qual as mudanças conformational podem ser medidas). A mudança conformational máxima (Cu) é 0.04nm e cada desafio era uma injecção 5 minuto. (Cortesia dos Dados de Gifu Univ., de Japão)

Mudanças Conformational em Filmes Finos

A matéria Macia (por exemplo polímeros) é igualmente sujeita às distorções similares e frequentemente ele é esta natureza maleável que é a característica de definição no nanoscale. A Interferometria Dupla da Polarização (DPI) é igualmente capaz de caracterizar estas mudanças nos polímeros, medindo a espessura de filme e o R.I. e o acordo com outras técnicas analíticas tais como a reflexão do nêutron e ellipsometry são2 excelentes como mostrado abaixo em Figura 2. Ao Contrário de ellipsometry, contudo, DPI determinará a espessura e RI independentemente de se em arbitrariamente para diluir camadas e ao contrário dos dados do nêutron, fará este no tempo real em um formato do benchtop com canais experimentais e de controle.

Figura 2. Comparação de DPI e medidas do ellipsometery de uma construção multilayer do polyelectrolyte. No acordo grosso das camadas para a espessura (d) e o R.I. (n) é excelente. Nas espessuras reduzidas ellipsometry exige o conhecimento do RI (ou da espessura) a fim calcular a espessura (ou RI) quando DPI puder medir arbitrariamente para diluir as camadas que revelam a oscilação na densidade associada com o positivo alternativo e negativamente - depósito cobrado das camadas. (Cortesia dos Dados de YKI, Éstocolmo)

Muitos outros exemplos de tais construções montadas auto foram por exemplo multilayers estudados, 3chitosano/heparina, 4e polyelectrolytes do ADN5,6.

Naturalmente há muitos tipos de reorganização conformational do interesse que não envolvem um evento obrigatório. A inchação do Polímero devido ao pH em mudança é um tal processo que pode rapidamente e facilmente ser caracterizado outra vez em uma definição associada normalmente com “a física grande”. Um exemplo simples é mostrado em Figura 3 onde um filme fino capturado superfície de poli (allylamine) é estudado através de uma escala dos pH. No baixo pH, o protonation do polímero fizer com que a camada inche quando no pH alto os contratos da camada e os aumentos da densidade.

Figura 3. inchação do Polímero devido ao protonation como medido pela Interferometria Dupla da Polarização

Estas medidas podem igualmente ser estendidas aos biopolymers onde as transições de um isoform ao outro e igualmente estabilidade do isoform podem ser caracterizadas em uma matriz de temperaturas diferentes, de pH, de concentrações iónicas, de solventes ou de outras circunstâncias ambientais ou refolding.

O Futuro da Interferometria Dupla da Polarização

Desde sua introdução em 20037, a Interferometria Dupla da Polarização foi adotada por uma vasta gama de pesquisadores em todo o mundo na vida e em ciências físicas. Sua capacidade para medir e caracterizar a conformação molecular na definição atômica secundária criou oportunidades fundamental novas para a pesquisa nano e bio da ciência. A geração a mais atrasada de instrumentação, a Bio Estação de trabalho 4D é capaz de uma temperatura prolongada a 65°C que permite a medida do derretimento da proteína e de outras transições de fase moleculars.

Caracterizando a cinética e a afinidade das interacções em temperaturas diferentes é igualmente possível determinar a energia livre, a entalpia e a entropia não somente da ligação mas igualmente de mudanças conformational8. Isto permite pela primeira vez a medida directa da afinidade, da cinética, do termodinâmica e da mudança conformational da ligação ou simplesmente de refolding em uma única experiência.

Figura 4. Um instrumento Duplo do benchtop do Interferómetro da Polarização com introdução automatizada da amostra.

No futuro uma produção mais alta e os volumes de amostra menores serão exigidos selecionando aplicações mas há muitos outros níveis de informação espectroscópica que podem igualmente ser extracted.from a Bio Estação de trabalho 4D. A Medida da nucleação de cristal da proteína da fase inicial9 tem sido demonstrada muito já usando a perda óptica enquanto o birefringence está sendo usado agora para medir o pedido e a desordem em bilayers do lipido10 para caracterizar interacções do lipido da proteína. 11Nossa visão para a próxima década é aumentar também a fidelidade da caracterização nestas dimensões para iluminar verdadeiramente o mundo molecular!


Referências

1. Swann M.J., Freeman N.J, Interferometria Transversal de G. Duplo Polarização: Uma Técnica Óptica do Tempo real para Medir (a Bio) Orientação, Estrutura e Função Moleculars Relação Contínua/Líquida. Em: Manual dos Biosensors e dos Biochips, Grupo de Volume 2 (2007). Eds: R.S. Marca, C.R. Lowe, C.C. Cullen, H.H. Weetall, I. Karube. Wiley, ISBN: 978-0-470-01905-4, Vol1, parte 4, ch33, pp549-568.
2. Halthur T., Claessen P., Elofsson U., Imobilização da Proteína do Derivado da Matriz do Esmalte no Polipeptídeo Multilayers, Medidas in situ Comparativas Usando Ellipsometry, Microbalança do Cristal de Quartzo com Dissipação, e Interferometria da Duplo-Polarização. Langmuir (2006) 22(26) 11065-71.
3. Lee L., Johnston A.P., Caruso F., Manipulando o sal e a estabilidade térmica de filmes multilayer do ADN através do comprimento do oligonucleotide. Biomacromolecules (2008) Novembro. 9(11): 3070-8. Epub 2008 o 1º de outubro.
4. Lundin M., Blomberg E., Tilton R.D., Dinâmica do Polímero nos Conjuntos da Camada-por-Camada do Chitosano e Heparina, Langmuir, Artigos O MAIS CEDO POSSÍVEL, Tâmara de Publicação (Web): 18 de novembro, (2009) (Artigo) DOI: 10.1021/la902968h.
5. Aulin C., Varga I., Claesson P.M., Wågberg L., Lindström T., Acúmulo de multilayers do polyelectrolyte do polyethyleneimine e celulose microfibrillated estudada pela interferometria in situ da duplo-polarização e pela microbalança do cristal de quartzo com dissipação. Langmuir, (2008) o 18 de março; 24(6): 2509-18. Epub (2008) o 16 de fevereiro.
6. Pista T.J., FletcherW. O R., Gormally, M.V., Johal M.S., Interferometria da Polarização do Duplo-Feixe Resolve Aspectos Mecanicistas da Adsorção do Polyelectrolyte. Langmuir, (2008) O MAIS CEDO POSSÍVEL Artigo, Data de Lançamento da Web: 10 de setembro, (2008).
7. Swann M.J., Freeman New Jersey, Carrington S., Ronan G., Barrett P., Determinando Mudanças Estruturais e Estequiometria de Interacções da Proteína Usando o Perfilamento do Tamanho e da Densidade. Letras na Ciência do Peptide (2003) 10 487-494.
8. Usando o van't Hoff e equações de Eyring.
9. Boudjemline A., Clarke D.T., Freeman New Jersey, Nicholson J.M., Jones G.R., Fases iniciais de cristalização da proteína como revelado pela tecnologia óptica emergente J. Appl do medidor de ondas. Cryst. (2008). 41, 523-530. doi: 10.1107/S0021889808005098.
10. Mashaghi A., Swann M., Popplewell J., Textor M., Reimhult E., anisotropia Óptica das estruturas apoiadas do lipido sondadas pela espectroscopia do medidor de ondas e sua aplicação ao estudo da cinética apoiada da formação do bilayer do lipido, Anal. Chem., 80 (10), 3666-3676, (2008). PMID: Data de Lançamento da Web 18517221: 19, Abril. (2008); (Artigo) DOI: 10.1021/ac800027s.
11. Sanghera N., Swann M.J., Ronan G., Pinheiro T.J., Introspecção em eventos adiantados na agregação da proteína do prião nas membranas do lipido, Biochimica e Acta de Biophysica (BBA) - Biomembranes, Volume 1788, Edição 10, Outubro (2009), Páginas 2245-2251.

Copyright AZoNano.com, Dr. Gerry Ronan (Grupo Em Campo Afastado)

Date Added: Feb 14, 2010 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 14. June 2013 01:48

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