AFM-IR : Représentation Subcellulaire Infrarouge avec un Microscope Atomique de Force

Par M. Alexandre Dazzi

M. Alexandre Dazzi, Paris-Lessive d'Université, Laboratoire de Chimie Physique, Batiment 201-P2, 91405 Orsay, France. Auteur Correspondant : alexandre.dazzi@u-psud.fr

Les outils existants disponibles pour effectuer la spectroscopie et la microscopie infrarouges à l'échelle de nanomètre sont limités considérant tous les différents microscopes de proche-zone. Cependant AFM-IR, un spectromicroscope infrarouge neuf accouplant un Microscope Atomique de Force (AFM) à un laser accordable, permet à des chercheurs de dériver l'information chimique sur une échelle pas précédemment possible. Le rendez-vous des bandes de l'absorption est non-ambigu permettant à des spectroscopists d'utiliser des spectres d'AFM-IR aussi facilement que ceux obtenus suivre des méthodes infrarouges classiques.

Le principe d'AFM-IR1 est d'accoupler le mode d'AFM en contact avec un laser (le Schéma accordable pulsé 1). Un échantillon est mis sur un prisme infrared-transparent et puis irradié avec le laser. Quand la longueur d'onde de laser est ajustée sur les bandes d'absorption de l'échantillon, la lumière laser absorbée entraîne une augmentation photothermique de la température dans les régions absorbantes de l'échantillon. Comme les augmentations de la température dues à l'absorption d'IR, l'échantillon augmente. L'expansion thermique locale est surveillée avec l'extrémité de l'AFM. L'expansion thermique rapide de l'échantillon produit d'une impulsion de force qui pilote l'encorbellement dans la vibration. Ainsi chaque fois que la pulsation lumineuse est absorbée et chauffe l'échantillon, l'encorbellement oscille à sa fréquence de résonance. L'amplitude est directement proportionnelle à l'énergie absorbée2, de ce fait menant aux spectres d'absorption qui sont promptement marqués pour entasser en vrac des techniques de spectroscopie d'IR comme FTIR. Comparé à FTIR, la sensibilité de la technique d'AFM-IR peut recenser chimiquement des échantillons sur l'échelle de taille des dizaines de nanomètre.

Le Schéma 1 : Schéma de technique d'AFMIR

La technique d'AFM-IR a été utilisée à notre centre de recherche (Laboratoire de Chimie Physique, Orsay, France) pendant cinq années. Les expériences ont été installées et passage au Laser Infrarouge de Centre d'Orsay (CLIO, http://clio.lcp.u-psud.fr/clio_eng/clio_eng.htm) et fournit maintenant un beamline permanent. CLIO est fait fonctionner d'une voie plutôt inhabituelle : Il nous permet d'offrir nos systèmes aux utilisateurs extérieurs d'autres organismes de recherche. Le cahier des charges de la source est d'être un laser à électrons libres réglable de 3 au µm 150. L'Accès est managé par un comité de programme assimilé à ceux aux centres de synchrotron. C'est dans ce contexte que nous avons pu collaborer sur plusieurs projets dans différentes zones, en particulier dans la biologie3,4,5,6,7, et dans le nanophotonics.8,9,10

Exemple d'Application en microbiologie : Emplacement de PHB dans le capsulatus de Rhodobacter6

Le capsulatus de Rhodobacter est une bactérie photosynthétique nonne soufré pourprée, qui produit un polymère, le polyhydroxybutyrate (PHB), pour son stockage de l'énergie sous la forme d'inclusion de vésicule. PHB appartient à une classe des polyester et a été utilisé pendant plusieurs années dans la production des plastiques ayant les propriétés mécaniques et thermoplastiques assimilées à ceux du polyéthylène et du polypropylène mais avec l'avantage de pouvoir utiliser les ressources renouvelables. La présence de PHB peut être sondée dans le domaine de mi-infrared par la présence des bandes d'absorption particulières, en particulier vers 1740 le cm-1 (C=Os d'ester), facilement perceptible d'autres bandes de bactéries : Amide I 1660 au cm-1, Amide II au cm 1550-1.

Les premières images sur le Schéma 2 affichent la topographie des bactéries obtenues par l'AFM classique. Les images inférieures affichent la cartographie chimique correspondante de PHB (à cm 1740-1). Sur tous les plans, nous avons localisé autour des zones où le signe est plus fort (les domaines rouges). Ces domaines correspondent aux granules de PHB à l'intérieur des bactéries (le Schéma 2 d, e, f). Sur chaque plan chimique, nous pouvons estimer la taille des granules en estimant la largeur à la demi hauteur. Figure que le 2d indique une grande granule ronde du diamètre et de la longue forme un de 210 nanomètre seulement de 50 nanomètre grands (haut de l'image). Cette longue forme est très susceptible le résultat de petites vésicules sphériques de PHB alignées près de la membrane. La Figure 2e affiche une bactérie sans vésicule de PHB. Ceci suggère que dans ces conditions d'élevage, toutes les bactéries de capsulatus de Rhodobacter ne produisent pas forcément PHB. La Figure 2f (zoom de Figure 2e) indique que la zone absorbante en fait se compose par deux vésicules adjacentes de différentes tailles.

Figure 2a : Topographie d'AFM d'un capsulatus unique de Rhodobacter.

Figure 2b : Topographie d'AFM de deux bactéries séparées Rhodobacter.

Figure 2c : Zoom d'AFM sur la bactérie la plus faible localisée sur b).

Figure le 2d : mappage chimique de PHB (à cm 1740-1) du topogaphy correspondant a).

Figure 2e : mappage chimique de PHB de b).

Figure 2f : mappage chimique de PHB de c).

Nous avons étudié la réaction de spectroscopie de la vésicule (Figure 2f) et comparé il avec le spectre de FTIR de la culture de bactéries (le Schéma 3). Le spectre sur une bactérie unique (dans Figure rouge 3a) a été mesuré en positionnant l'extrémité de l'AFM directement sur le maximum du signe utilisant le mappage chimique de PHB (comme dirigé par Figure 3b). Nous observons une bande forte de C=O de l'ester (centré à cm 1740-1) attendu que la bande I de l'Amide Au cm 1660-1 semble plus faible et bruyante, expliquant la nature de PHB du mappage de point chaud de la Figure 3b. Le deuxième spectre a été enregistré en positionnant l'extrémité à la remarque B (le Schéma 3) au cadre de la vésicule d'absorption. Le spectre affiche un meilleur signe pour l'Amide I qui est assimilée au spectre de FTIR de la culture de bactéries (le Schéma 3 en vert). L'intensité du PHB dans ce cas a diminué comparé à la position précédente, qui est compatible avec le mappage chimique de PHB. Quand l'extrémité est positionnée à C (le Schéma 3), hors de la vésicule, le spectre d'AFM-IR n'affiche pas la bande de C=O (sur le Schéma violet 3).

Figure 3a : Comparaison entre (A en rouge, B dans l'orange, C dans la violette) les spectres locaux d'AFM-IR et le spectre de FTIR (en vert) de la culture de bactéries.

Figure 3b : mappage chimique de bactérie de C=O de bande d'ester avec la position correspondante (A, B, C) des mesures de spectres.

Ces résultats sont de plus grand intérêt car AFM-IR est une technique non envahissante qui peut être appliquée directement à l'étude des cellules. Grâce à cette technique, nano-définition est maintenant possible pour la représentation utilisant la radiothérapie d'IR. Ceci rend la représentation d'IR possible à l'échelle sous-cellulaire, une découverte dans l'IR-mappage. Spectromicroscopy représente un puissant outil pour déterminer la composition ultra-locale dans le cellulo

Relâché en 2010, AFM-IR est maintenant disponible comme instrument commercial de benchtop : le nanoIR, développé et vendu par Anasys Instruments Inc.


Références

[1] A. Dazzi, R. Prazeres, F. Glotin, J.M. Ortega, Choisissent. Lett. 30, 2388 (2005).

[2] A. Dazzi, F. Glotin, et R. Carminati, J. Appl. Phys. 107, 124519 (2010)

[3] A.Dazzi, R.Prazeres, F.Glotin, J.M.Ortega, Physique Infrarouge et Technologie, 49, 113 (2006).

[4] A.Dazzi, R.Prazeres, F.Glotin, J.M.Ortega, M.Alsawaftah, M.De Frutos, Ultramicroscopie 108, 635-641, (2008).

[5] C. Mayet, A. Dazzi, R. Prazeres, F. Allot, F. Glotin, J.M. Ortega, Choisissent. Lett. 33,1611-1613 (2008).

[6] C. Mayet, A. Dazzi, R. Prazeres, J. - M. Ortega, D. Jaillard, Analyste 135, 2540-2545 (2010).

[7] C. Policar, J.B. Waern, M.A. Plamont, S. Clède, C. Mayet, R. Prazeres, J. - M. Ortega, A. Vessières, et A. Dazzi, Édition Internationale d'Angewandte Chemie, Vol. 50, Délivrance 4, 860-864, (2011).

[8] J.Houel, S.Sauvage, P.Boucaud, A.Dazzi, R.Prazeres, F.Glotin, J.M.Ortéga, A.Miard, A.Lemaître, Rev Lett 99, 217404 de Phys (2007).

[9] J. Houel, E. Homeyer, S. Sauvage, P. Boucaud, A. Dazzi, R. Prazeres, J.M.Ortega, Bloc Optique Exp., 17, 10887-10894 (2009).

[10] S. Sauvage, A. Driss, F. Réveret, P. Boucaud, A. Dazzi, R. Prazeres, F. Glotin, J. - M. Ortéga, A. Miard, Y. Halioua, F. Raineri, I. Sagnes et A. Lemaître, Phys. Rev. B 83, 035302 (2011).

Date Added: Jul 17, 2011 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 14. June 2013 09:18

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