Microscopie Atomique de Force : Représentation Quantitative des Échantillons Biologiques Vivants utilisant PeakForce QNM

Par AZoNano

Table des matières

Introduction
Mécanique d'AFM et de Cellules
Quantification Facile et À haute résolution des Propriétés Mécaniques Témoin
Quantification Directe des Signes d'AFM sur des Échantillons Biologiques
Échantillons Biologiques de Représentation avec PeakForce QNM
Dynamique de Cellules de Surveillance en temps réel
AFM de Recouvrement et Tunnels Optiques
Conclusion
Au Sujet de Bruker

Introduction

C'est un fait réputé que la détermination des propriétés mécaniques des cellules vivantes ex vivo peut indiquer la santé de l'organisme dont ils ont été extraits. En Particulier en mode de force, l'AFM est un outil diagnostique et d'investigation puissant. La spectroscopie de Force a beaucoup d'inconvénients tels que moins de définition, vitesse de saisie, et elle ne fournit pas les informations quantitatives nécessaires. PeakForce QNM a été développé par Bruker pour offrir des données instructives à la haute résolution avec la simplicité d'utilisation remarquable.

Mécanique d'AFM et de Cellules

Depuis son développement, l'AFM est un outil de choix aux échantillons biologiques mous superbes d'image, particulièrement avec l'émergence de la spectroscopie de TappingMode™ et de force et du fait qu'il est l'une des quelques techniques de microscopie qui permet l'observation des cellules dans des conditions proche-physiologiques. L'AFM est employé souvent pour marquer le comportement et la migration des cellules ou la division élastique. L'immense majorité de ces derniers étudie sont basée sur TappingMode, courbures d'unique-force, ou mesures de force-volume.

TappingMode offre l'avantage d'appliquer les forces négligeables de nominal, de friction et de cisaillement, et la représentation de phase réfléchit l'énergie dissipée entre l'extrémité et l'échantillon pendant chaque prise sur la surface. Le volume de Force est une autre technique puissante basée sur des mesures de force réalisées sur une modification des remarques définies par l'utilisateur. La Raideur et l'adhérence entre l'extrémité et l'échantillon peuvent être extraites de chaque courbure de force. Au cas où l'extrémité functionalized avec une molécule d'intérêt, des événements défaisants particuliers peuvent également être recensés sur la courbure de rétraction. Pour surmonter ces goulots d'étranglement, Bruker a développé PeakForce QNM.

Quantification Facile et À haute résolution des Propriétés Mécaniques Témoin

PeakForce QNM active l'extraction directe d'information nanomechanical quantitative des échantillons biologiques sans endommager l'échantillon. Il a basé sur la technologie de Filetage de Force Maximale, pendant laquelle la sonde est oscillée de la même façon pendant qu'elle est dans TappingMode, mais à loin ci-dessous la fréquence de résonance (1 ou 2 kilohertz selon l'outil). Chaque fois que l'extrémité et l'échantillon sont rassemblés, une courbure de force est capturée. Cependant, où la boucle de contre-réaction met à jour la constante de filetage d'amplitude dans TappingMode, contrôles de Filetage Maximaux de Force la force maximale maximum sur la sonde. Ces forces peuvent être réglées aux niveaux beaucoup inférieurs au mode de contact et même inférieur TappingMode permettant le fonctionnement sur même les échantillons biologiques les plus fragiles.

Le Schéma 1 affiche les différentes zones de force remarquées par la sonde pendant un cycle d'élan-rétraction, ainsi que tous information qui peut être extraite de la force produite courbe. Quand la sonde approche l'échantillon (chiffre 1a), elle a abaissé vers la surface par les forces attrayantes, qui sont principalement capillaires, Van der Waals et les forces électrostatiques. À la remarque B, ces forces négatives sont plus haut que la raideur de l'encorbellement, qui fait tirer à la surface et puis commencer l'extrémité à mettre en retrait dans l'échantillon jusqu'à ce que la Z-Position de la modulation atteigne son maximum (remarque C). Cette position représente la valeur maximale maximum de force, qui est utilisée pour le contrôle de contrôle par retour de l'information. Après cette remarque, la sonde commence à se replier jusqu'à ce qu'elle atteigne la remarque de traction-hors circuit (la remarque maximum d'adhérence, qui correspond également à la force minimum). Alors l'extrémité continue de se rétracter et atteint de nouveau à sa position initiale (e) où (comme dans A) plus de domaine de force n'affecte son mouvement.

Le Schéma 1. principe de Fonctionnement de PeakForce QNM. Tandis Que la sonde est oscillée, une courbure de force est enregistrée pour chaque pixel de l'image. Pour distinguer les différentes parties de la trajectoire d'extrémité, cet exemple a été enregistré à l'aide d'une sonde de TAP150A, qui est type utilisée à l'image les échantillons plutôt raides et faiblement conformes. Sur des échantillons biologiques, la force maximale typique peut être jusqu'mille fois à plus bas.

Ce modèle de mécanique suppose que le principe de contact demeure le même que dans le modèle Hertzien mais considère des interactions attrayantes supplémentaires orientées à l'intérieur d'un anneau situé en dehors de la zone de contact (chiffre 2a). Dans ce cas, et vu le contact entre une sphère et un demi-espace élastique, la force est liée à la déformation par :

là où E* représente le module, le R le radius d'extrémité et le d De Young réduits la profondeur de déformation.

Éventuellement, l'énergie dissipée par l'extrémité et l'échantillon pendant chaque prise sur la surface est obtenue en intégrant la zone entre l'élan et les courbures de rétraction.

Quantification Directe des Signes d'AFM sur des Échantillons Biologiques

Quand la sonde est étalonnée avant l'expérience, tous les signes mentionnés ci-dessus seront directement quantitatifs. Cet étalonnage peut être fait comme suit :

  1. Engagez une partie raide de l'échantillon (comme la glace) et enregistrez une courbure de force à partir dont la sensibilité de déviation peut être prévue.
  2. Retirez et prévoyez la constante de source utilisant « l'Air Thermique ».
  3. Enregistrez une image de topographie de l'échantillon de Tipcheck pour obtenir une valeur du radius R. d'extrémité.
  4. Après avoir écrit la valeur prévue de R, la déformation est réglée sur un échantillon de choix. L'échantillon à balayer devrait avoir les propriétés mécaniques assimilées comme échantillon biologique qui sera vérifié pendant l'expérience.

Sur la plupart des échantillons testés, un ajustement de Sneddon a été employé pour extraire le module De Young en capturant un fichier de HSDC (Saisie de Données À grande vitesse) sur une ligne d'échographie très à un de haute résolution. Quand les profils de force et de hauteur sont comparés, les pièces non-désirées (courbures de force capturées sur une partie de l'échantillon qui n'est pas d'intérêt, tel que la glace) peuvent être exclues manuellement. Les courbures de force restante peuvent être exportées comme fichier unique, post-traité par un programme externe, et le module De Young moyen peut être prévu en considérant différentes théories de contact, telles que le le modèle de Sneddon.

Cette théorie mécanique considère le contact entre un demi-espace élastique déformé par un pénétrateur conique rigide (chiffre 2b), déterminant que la charge est proportionnelle au carré de la profondeur de pénétration. La profondeur d'indentation et le radius d'extrémité sont associés par :

Le Schéma 2. mécanique de Contact dans l'AFM. Dans a, l'ajustement de DMT est basé sur une supposition Hertzienne mais déclare que les forces d'adhérence sont orientées en dehors de la zone de contact. Ceci est bien adapté aux polymères à haute densité et aux échantillons faiblement déformables. À b, l'ajustement de Sneddon considère l'extrémité comme pénétrateur conique infini, qui est bien adapté aux échantillons mous (biologique) et déformables.

Sur de tels échantillons, un large éventail de sondes d'AFM ont été testées et la recommandation est donnée sur le schéma 3. Les sondes existantes les plus molles sur le marché sont OBL-B, qui ont une constante nominale de source de 0,006 N/m et sont ainsi appropriés de vérifier les cellules vivantes molles superbes, telles que des neurones.

Le Schéma 3. Domaine de la conformité des échantillons biologiques variés et de l'AFM correspondant sonde recommendé pour le Filetage Maximal de Force. Selon leur type, les cellules eucaryotes peuvent présenter les propriétés mécaniques très différentes. Les Neurones peuvent être extrêmement mous (vers le bas à 1kPa) attendu que la cellule d'os peut être aussi robuste que des bactéries. Afin de sonder correctement les propriétés de cellules, sélectant la bonne constante de source et la sensibilité est ainsi obligatoire.

Échantillons Biologiques de Représentation avec PeakForce QNM

Des échantillons biologiques Marins se composent souvent de mélange des composants mous et rigides. Un échantillon de l'eau prélevé de la Mer Adriatique A été mis sur une lamelle de verre et vérifié par PeakForce QNM. Autre que des observations très appropriées sur les diatomées vivantes, quelques débris de paroi cellulaire ont été également trouvés dans la suspension. Le Schéma 4 donne un exemple à quoi ces structures ressemblent. Le profil 3D-topography indique une structure comme une gaufre caractéristique avec des pores 100 nanomètre dans la taille et une hauteur moyenne de 20 nanomètre. Le tunnel d'adhérence affiche un contraste marqué entre le bas des pores (environ 50 NA à la moyenne) et le reste de la paroi cellulaire (moins de 20 NA). Cependant, les tunnels les plus instructifs sont l'élasticité et les données de déformation. Sur les deux tunnels les trois parties du frustule sont distinguées, chacun qui présente les propriétés mécaniques de manière dégagée différentes : le centre du pore (module De Young moyen de ~300 kPa et de déformation moyenne de ~7 nanomètre), la sonnerie autour du pore (~75 kPa et ~25 nanomètre) et la pièce de noyau de la paroi cellulaire, qui semble avoir les propriétés mécaniques intermédiaires (~200 kPa et ~10 nanomètre).

Le Schéma 4. Représentation de la paroi cellulaire de phytoplancton avec un Catalyseur AFM de BioScope. En haut à gauche : image de microscopie électronique d'une diatomée, accueil de groupe de Dennis Kunkel, Astrographics. La Plupart des tunnels de PeakForce QNM fournissent un contraste remarquable et des caractéristiques techniques à haute résolution.

Des expériences Supplémentaires ont été effectuées sur des bactéries d'Escherichia coli K12. À La Différence de la majeure partie de substances d'Escherichia coli, les tensions K12 peuvent se multiplier dans l'intestin et sont particulièrement résistantes aux anticorps. Une de leurs autres caractéristiques est qu'elles possèdent le pili (voir le chiffre 5a) que rétractez type dans les conditions d'épuisement ou n'importe quel environnement de tension. Jusqu'ici, la représentation ces bactéries vivantes avec l'AFM, en n'importe quel mode, a été un défi considérable et un résultat historiquement évasif.

Le Schéma 5 affiche des images haute résolution de telles bactéries vivantes, facilement obtenues dans moins d'une heure. Comme peut être vu sur le 3D-representation du tunnel de hauteur (chiffre 5b), le pili ne sont plus visible, qui peut être expliqué par le fait qu'extrayant de leur support de suspension et les écartant sur un paraboloïde induit un stress qui fait rétracter à ceux le pili. La Figure 5c affiche le tunnel de module de DMT. À l'aide d'un ajustement de Sneddon, le module De Young moyen a été déterminé pour être 183 kPa, qui apparie parfaitement des observations précédentes.

Le Schéma 5. bactéries d'Escherichia coli K12 imagées par PeakForce QNM sur un Catalyseur AFM de BioScope. Dans a, la structure de la tension est tirée. À b, une représentation 3D-height d'AFM 10x10μm d'une batterie des bactéries est affichée. En c, tunnel De Young de module (z-échelle : 0-4GPa) est dépeint. C'est la première fois que de telles bactéries a été vivante imagé par l'AFM.

Dynamique de Cellules de Surveillance en temps réel

Toutes Les cellules vivantes sont dynamiques, se déformer dû au réarrangement de leur échafaudage de cytosquelette et propagation et migrer sur le substrat de culture cellulaire. Ces procédés et les modifications mécaniques qui les accompagnent peuvent être surveillés utilisant le PeakForce QNM. Dans un autre ensemble d'expériences, PeakForce QNM a été employé pour vérifier des cellules de glioblastome. Le Glioblastome sont de loin la forme la plus commune et la plus maligne du cancer du cerveau. Les cellules Vivantes de glioblastome ont été imagées par PeakForce QNM sur le Catalyseur de BioScope et vivant mis à jour pendant la période de l'expérience en employant la PSI. Cette technologie permet à l'utilisateur de s'appliquer très un doux à la force modérée sur l'échantillon, selon l'information requise. En appliquant une force très légère sur l'échantillon, les caractéristiques techniques le plus élevé de la cellule (glycocalice, protrusions) peuvent être sondées. D'autre part, une force légèrement plus élevée est exigée pour sentir les organelles et le cytosquelette situés sous la membrane de plasma. Le Sondage des propriétés mécaniques réelles de l'échantillon exige également l'indentation de l'échantillon (et fléchissez ainsi dans l'encorbellement) par au moins cents nanomètres. Figure qu'expositions 6a qu'une image haute résolution typique a obtenues sur le glioblastome vivant tout en appliquant une force modérée (~300 NA).

Le Schéma 6. Images des cellules vivantes de glioblastome par PeakForce QNM et le Catalyseur AFM de BioScope. Dans a, l'image de hauteur de 40x40μm enregistrée à une force modérée affiche les structures le plus élevé et internes. À b, le transparent 3D de 15x15μm des tunnels de topographie et de déformation est affiché. Le Catalyseur du BioScope de Bruker avec Inonder l'Incubateur de Stade offre le meilleur reste de la représentation de cellules vivantes pour des expériences à long terme.

Keratinocytes sont les composants principaux de la couche extérieure de la peau humaine. Étudiant de telles cellules par des chercheurs d'aides d'AFM comprennent le procédé du cancer de la peau ou d'autres handicaps.

HaCat est une lignée cellulaire immortelle des keratinocytes humains qui est largement vérifiée en cytologie et représente également un bon candidat pour explorer le potentiel de PeakForce QNM. Les cellules ont été exposées à un agent oxydant capable d'induire un stress. En réponse à cette agression chimique, les cellules tendent à transformer et synthétiser de soi-disant fibres de stress d'actine. Une image à résolution moyenne typique est affichée sur le schéma 7.

Le Schéma 7. image de Catalyseur et de PeakForce QNM de BioScope de 75x75μm des cellules vivantes de HaCat sous le stress oxydant. Les cellules réagissent en synthétisant rapidement des fibrilles de stress pour déterminer des contacts avec les cellules adjacentes. De Tels procédés dynamiques peuvent également être cheminés à l'aide de cette technique.

Dans PeakForce QNM, une courbure de force est effectuée pour chaque pixel de l'image, ainsi la définition est la même sur tous les tunnels. Cet exemple illustre combien facile et jeûne (des images de définition du pixel 384x384 peuvent être capturées en 6 à 9 mn) il est à directement et de la façon quantitative une sonde change dans la topographie et les propriétés mécaniques des cellules vivantes en réponse aux traitements médicamenteux.

AFM de Recouvrement et Tunnels Optiques

Un Un Autre des défis principaux actuels pour des applications biologiques est de pouvoir obtenir l'information optique et d'AFM simultanément. La caractéristique technique exclusive d'Inscription et de Transparent d'Image du Microscope de Bruker (MIRO™) peut être employée pour importer facilement des images optiques/fluorescence dans le logiciel de NanoScope® et pour les recouvrir avec des images d'AFM. Après un étalonnage court, l'utilisateur peut sélecter l'emplacement pour effectuer l'AFM balayer. Ainsi l'échantillon automatiquement peut être déménagé à la position désirée et l'image d'AFM peut être pixel capturé par le pixel, et entièrement intégré dans l'image optique.

Le Schéma 8 affiche un transparent réalisé sur les cellules endothéliales vivantes. L'image de fluorescence (double-souillant DAPI pour le noyau et le á-phalloidin pour des filaments d'actine) est réglée comme mouvement propre et superposée avec une image d'AFM effectuée d'un mélange de deux tunnels : erreur maximale de force et module De Young. La transparence a été réglée à 50% de sorte qu'une corrélation directe puisse être effectuée entre les différentes parties des cellules (visibles par la topographie et la fluorescence d'AFM) et leurs propriétés mécaniques correspondantes (tunnel De Young d'AFM de module). À b, c et d l'erreur maximale individuelle de force, module De Young et images d'AFM de déformation sont représentés. Il peut de manière dégagée voir dans l'élasticité et les tunnels de déformation qui sur les arêtes des cellules où l'épaisseur est si basse, l'influence de l'échafaudage (glace) sur les propriétés mécaniques de l'échantillon sont non négligeables, attendu que sur la pièce de noyau des cellules, le module De Young moyen est beaucoup plus fiable (45,3 kPa). Pour une question de clarté, seulement trois tunnels d'AFM sont affichés ici, mais huit signes différents peuvent être affichés simultanément.

Le Schéma 8. Transparent de la fluorescence et images d'AFM des cellules vivantes de HUVEC produites avec MIRO sur un Catalyseur de BioScope. Les principaux bénéfices de MIRO sont d'activer l'affichage d'information optique et d'AFM simultanément. En fonctionnant avec les sondes functionalized, une option de « Remarque et de Pousse » peut également être employée pour déclencher exactement la mesure de force aux emplacements désirés sans détruire le ligand.

Conclusion

Les applications affichées ci-dessus expliquent que le Filetage de Force de Crête est de loin le plus puissant et aujourd'hui disponible de haute définition de technique quantitative d'AFM pour sonder le produit chimique quantitatif et les propriétés mécaniques des échantillons biologiques vivants avec une saisie accélèrent comparable à TappingMode. Le nombre de différentes propriétés mécaniques qui peuvent être caractérisées dépasse cela d'autres modes utilisés généralement d'AFM. Son potentiel prépare le terrain pour beaucoup d'applications neuves excitantes dans le domaine de la biologie, particulièrement dans la cancérologie et les maladies cardio-vasculaires.

Au Sujet de Bruker

Les Surfaces Nanoes de Bruker fournit les produits Atomiques de Microscope de Force/de Microscope Sonde de Lecture (AFM/SPM) qui restent à l'extérieur d'autres systèmes disponibles dans le commerce pour leur design et facilité d'utilisation robustes, tout en mettant à jour le plus de haute résolution. Le chef de mesure de NANOS, qui fait partie de tous nos instruments, utilise un seul interféromètre fibreoptique pour mesurer le fléchissement en porte-à-faux, qui effectue le contrat d'installation ainsi qu'il n'est pas plus grand qu'un objectif normal de microscope de recherches.

Cette information a été originaire, révisée et adaptée des matériaux fournis par des Surfaces de Nano de Bruker.

Pour plus d'informations sur cette source, visitez s'il vous plaît les Surfaces de Nano de Bruker.

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:09

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