Microscopia Atomica della Forza: Rappresentazione Quantitativa dei Campioni Biologici Viventi facendo uso di PeakForce QNM

Da AZoNano

Indice

Introduzione
Meccanici delle Cellule e del AFM
Quantificazione Facile e Ad Alta Definizione dei Beni Meccanici del Campione
Quantificazione Diretta dei Segnali del AFM sui Campioni Biologici
Campioni Biologici di Rappresentazione con PeakForce QNM
Dinamica delle Cellule di Video in tempo reale
AFM Sovrapponente e Canali Ottici
Conclusione
Circa Bruker

Introduzione

È un fatto ben noto che determinare i beni meccanici delle celle viventi ex vivo può indicare la salubrità dell'organismo da cui sono stati estratti. Specialmente nel modo della forza, il AFM è uno strumento diagnostico e d'investigazione potente. La spettroscopia della Forza presenta molti svantaggi quale meno risoluzione, la velocità di acquisizione e non fornisce informazioni quantitative necessarie. PeakForce QNM è stato sviluppato da Bruker per offrire i dati informativi all'alta risoluzione con facilità d'uso notevole.

Meccanici delle Cellule e del AFM

Dal suo sviluppo, il AFM è uno strumento della scelta ai campioni biologici molli eccellenti di immagine, particolarmente con l'emergenza della spettroscopia della forza e di TappingMode™ e del fatto che è una delle poche tecniche di microscopia che permette l'osservazione delle celle nelle circostanze quasi-fisiologiche. Il AFM è usato spesso correlare il comportamento e migrazione o divisione elastica delle cellule. La vasta maggioranza di questi studia è basata su TappingMode, sulle curve della unico forza, o sulle misure del forza-volume.

TappingMode offre il vantaggio di applicazione delle forze trascurabili di termine nominale, di attrito e di taglio e la rappresentazione di fase riflette l'energia dissipata fra il suggerimento ed il campione durante l'ogni rubinetto sulla superficie. Il volume della Forza è un'altra tecnica potente basata sulle misure della forza raggiunte su una matrice dei punti definiti dall'utente. La Rigidezza e l'aderenza fra il suggerimento ed il campione possono essere estratte da ogni curva della forza. Nel caso il suggerimento functionalized con una molecola di interesse, gli eventi scioglienti specifici possono anche essere identificati sulla curva di ritrazione. Per sormontare questi gravi ostacoli, Bruker ha sviluppato PeakForce QNM.

Quantificazione Facile e Ad Alta Definizione dei Beni Meccanici del Campione

PeakForce QNM permette all'estrazione diretta di informazioni nanomechanical quantitative dai campioni biologici senza danneggiare il campione. Ha in base alla tecnologia di Spillatura della Forza Di Punta, durante cui la sonda è oscillata in modo simile mentre è in TappingMode, ma a lontano sotto la frequenza di risonanza (1 o 2 chilocicli secondo lo strumento). Ogni volta il suggerimento ed il campione sono riuniti, una curva della forza è catturata. Tuttavia, dove il ciclo di feedback mantiene l'ampiezza di spillatura costante in TappingMode, comandi di Spillatura Di Punta della Forza la forza di punta massima sulla sonda. Queste forze possono essere controllate ai livelli molto più bassi del modo di contatto e perfino inferiore a TappingMode permettendo l'operazione anche sui campioni biologici più delicati.

Figura 1 mostra i campi di forza differenti sperimentati dalla sonda durante un ciclo di approccio-ritiro come pure tutte le informazioni che possono essere estratte dalla forza generata curvano. Quando la sonda si avvicina al campione (figura 1a), ha tirato giù verso la superficie con le forze attraenti, che sono pricipalmente capillari, Van der Waals e le forze elettrostatiche. A punto B, quelle forze negative diventano più superiore alla rigidezza della trave a mensola, che induce il suggerimento a tirare nella superficie e poi a cominciare rientrare nel campione finché la Z-Posizione della modulazione non raggiunga il suo massimo (punto C). Questa posizione rappresenta il valore di punta massimo della forza, che è usato per il controllo feedback. Dopo questo punto, la sonda comincia ritirarsi finché non raggiunga il punto di tirata-fuori (il punto massimo di aderenza, che egualmente corrisponde alla forza minima). Poi il suggerimento continua a ritirare e raggiunge di nuovo alla sua posizione originale (E) dove (come in A) non più campo di forza pregiudica il suo moto.

Figura 1. principio di Funzionamento di PeakForce QNM. Mentre la sonda è oscillata, una curva della forza è registrata per ogni pixel dell'immagine. Per distinguere fra le parti differenti della traiettoria del suggerimento, questo esempio è stato registrato usando una sonda di TAP150A, che è usata tipicamente all'immagine campioni piuttosto rigidi e male compiacenti. Sui campioni biologici, la forza di punta tipica può spettare mille volte a in basso.

Questo modello dei meccanici suppone che il principio del contatto rimane lo stesso di nel modello Hertziano ma considera le interazioni attraenti supplementari messe a fuoco dentro un anello situato fuori dell'area di contatto (figura 2a). In quel caso e tenendo conto del contatto fra una sfera e un semispazio elastico, la forza è collegata con la deformazione vicino:

dove E* rappresenta il modulo, la R il raggio del suggerimento e la d Di Young diminuiti la profondità di deformazione.

Finalmente, l'energia dissipata dal suggerimento ed il campione durante l'ogni rubinetto sulla superficie è ottenuta integrando l'area fra l'approccio e le curve di ritrazione.

Quantificazione Diretta dei Segnali del AFM sui Campioni Biologici

Quando la sonda è calibrata prima dell'esperimento, tutti i segnali detti precedentemente saranno direttamente quantitativi. Questa calibratura può essere effettuata come segue:

  1. Impegni una parte rigida del campione (come vetro) e registri una curva della forza da cui la sensibilità di deformazione può essere calcolata.
  2. Ritiri e calcoli la sorgente costante facendo uso “dell'Aria Termica„.
  3. Registri un'immagine della topografia del campione di Tipcheck per ottenere un valore del raggio R. del suggerimento.
  4. Dopo avere entrato nel valore stimato della R, la deformazione è regolato su un campione della scelta. Il campione da scandire dovrebbe avere simili beni meccanici come il campione biologico che sarà studiato durante l'esperimento.

Su la maggior parte dei campioni provati, una misura di Sneddon è stata usata per estrarre il modulo Di Young catturando un file di HSDC (Acquisizione Di Dati Ad alta velocità) su una linea di scansione molto ad un di alta risoluzione. Quando i profili di altezza e della forza sono confrontati, le parti non desiderate (le curve della forza hanno catturato su una parte del campione che non è di interesse, quale vetro) possono escludersi manualmente. Le curve della forza restante possono essere esportate come singolo file, post-elaborato da un programma esterno ed il modulo Di Young medio può essere calcolato considerando le teorie differenti del contatto, quale il modello di Sneddon.

Questa teoria meccanica considera il contatto fra un semispazio elastico deforme da un penetratore conico rigido (figura 2b), determinante che il caricamento sia proporzionale al quadrato della profondità di infiltrazione. La profondità della dentellatura ed il raggio del suggerimento sono riferiti vicino:

Figura 2. meccanici del Contatto in AFM. In a, la misura del CCL*DMT è basata su un presupposto Hertziano ma specifica che le forze di aderenza sono messe a fuoco fuori dell'area di contatto. Ciò si adatta bene ai polimeri ad alta densità ed ai campioni male deformabili. In b, la misura di Sneddon considera il suggerimento come penetratore conico infinito, che si adatta bene ai campioni molli (biologico) e deformabili.

Su tali campioni, una vasta gamma di sonde del AFM sono state provate e la raccomandazione si arrende figura 3. Le sonde esistenti più molli sul servizio sono OBL-B, che hanno una costante nominale della sorgente di 0,006 N/m e sono così appropriati da studiare le celle viventi molli eccellenti, quali i neuroni.

Figura 3. Intervallo di conformità di vari campioni biologici e delle sonde corrispondenti del AFM raccomandati per la Spillatura Di Punta della Forza. Secondo il loro tipo, le celle eucariotiche possono presentare i beni meccanici molto differenti. I Neuroni possono essere estremamente molli (giù a 1kPa) mentre la cella di osso può essere robusta quanto i batteri. Per sondare correttamente i beni delle cellule, selezionando la giusta sorgente costante e la sensibilità è così obbligatoria.

Campioni Biologici di Rappresentazione con PeakForce QNM

I campioni biologici Marini sono composti spesso di miscela delle componenti molli e rigide. Un campione dell'acqua prelevato dal Mare Adriatico è stato messo su una lastra di vetro ed è stato studiato da PeakForce QNM. Non le osservazioni molto pertinenti sulle diatomee viventi, alcuni resti della parete cellulare egualmente sono stati trovati nella sospensione. Figura 4 fornisce un esempio come quelle strutture guardano. Il profilo 3D-topography rivela una struttura del tipo di cialda caratteristica con i pori 100 nanometro nella dimensione ed in un'altezza media di 20 nanometro. Il canale di aderenza mostra un profondo contrasto fra il fondo dei pori (circa 50 PN nella media) ed il resto della parete cellulare (meno di 20 PN). Tuttavia, i canali più informativi sono l'elasticità ed i dati di deformazione. Su entrambi canali le tre parti del frustule sono distinte, ciascuno che presenta i beni meccanici chiaramente differenti: il centro del poro (un modulo Di Young medio del kPa ~300 e di una deformazione media di ~7 nanometro), l'anello intorno al poro (~75 kPa e ~25 nanometro) e la parte di memoria della parete cellulare, che sembrano avere beni meccanici intermedi (~200 kPa e ~10 nanometro).

Figura 4. Rappresentazione della parete cellulare del fitoplancton con un Catalizzatore AFM del BioScope. Sinistro Superiore: immagine di una diatomea, cortesia di microscopia elettronica del campione di Dennis Kunkel, Astrographics. La Maggior Parte dei canali di PeakForce QNM forniscono un contrasto notevole e le funzionalità ad alta definizione.

Gli esperimenti Supplementari sono stati effettuati sui batteri di Escherichia coli K12. A Differenza della maggior parte delle specie di Escherichia coli, gli sforzi K12 possono moltiplicarsi nell'intestino e sono particolarmente resistenti agli anticorpi. Una delle loro altre caratteristiche è che possiedono il pili (si veda la figura 5a) che ritiri tipicamente nell'ambito delle circostanze di svuotamento o di tutto l'ambiente di sollecitazione. Finora, la rappresentazione quei batteri vivi con il AFM, in tutto il modo, è stata una considerevole sfida e un risultato storicamente evasivo.

Figura 5 mostra le immagini ad alta definizione di tali batteri viventi, ottenute facilmente in meno di un'ora. Può essere veduto sul 3D-representation del canale di altezza (figura 5b), il pili non è più visibile, che può essere spiegato dal fatto che estraendo dal loro media della sospensione e spargendoli su un piatto induce uno sforzo che induce quelli il pili a ritirare. La Figura 5c mostra il canale del modulo del CCL*DMT. Usando una misura di Sneddon, il modulo Di Young medio è stato determinato per essere kPa 183, che abbina perfettamente le osservazioni precedenti.

Figura 5. batteri di Escherichia coli K12 imaged da PeakForce QNM su un Catalizzatore AFM del BioScope. In a, la struttura dello sforzo è estratta. In b, una rappresentazione 3D-height del AFM 10x10μm di un cluster dei batteri è indicata. In c, canale Di Young del modulo (z-disgaggio: 0-4GPa) è descritto. Ciò è la prima volta che tali batteri è stato vivo imaged dal AFM.

Dinamica delle Cellule di Video in tempo reale

Tutte Le celle viventi sono dinamiche, deformare dovuto la riorganizzazione della loro impalcatura del citoscheletro e spargersi e migrare sul substrato della coltura cellulare. Questi trattamenti ed i cambiamenti meccanici che li accompagnano possono essere riflessi facendo uso del PeakForce QNM. In un'altra serie di esperimenti, PeakForce QNM è stato usato per studiare le celle di glioblastoma. Glioblastoma è di gran lunga il modulo più comune e più maligno di tumore al cervello. Le celle Viventi di glioblastoma sono state imaged da PeakForce QNM sul Catalizzatore del BioScope e da vivo mantenuto per il periodo dell'esperimento mediante l'uso dello PSI. Questa tecnologia permette che l'utente applichi molto un delicato a forza moderata sul campione, secondo le informazioni state necessarie. Nell'applicare una forza molto leggera sul campione, le funzionalità superiori della cella (glicocalice, sporgenze) possono essere sondate. D'altra parte, una forza leggermente più elevata è richiesta per percepire gli organelli ed il citoscheletro situati al di sotto della membrana di plasma. Il Sondaggio dei beni meccanici reali del campione egualmente richiede la dentellatura del campione (e fletta così nella trave a mensola) almeno da cento nanometri. Calcoli che manifestazioni 6a un'immagine ad alta definizione tipica ha ottenuto sul glioblastoma vivente mentre applicava una forza moderata (~300 PN).

Figura 6. Immagini che delle celle viventi di glioblastoma da PeakForce QNM ed il Catalizzatore AFM del BioScope. In a, l'immagine di altezza di 40x40μm registrata ad una forza moderata mostra sia le strutture superiori che interne. In b, il foglio di prova 3D di 15x15μm dei canali di deformazione e della topografia è indicato. Il Catalizzatore del BioScope di Bruker con Irrorare l'Incubatrice della Fase offre il migliore bilanciamento della rappresentazione delle cellule viventi per gli esperimenti a lungo termine.

Keratinocytes è le componenti principali del livello esterno dell'interfaccia umana. Studiando tali celle dai ricercatori di guide del AFM capiscono il trattamento del cancro di interfaccia o di altri danni.

HaCat è una linea cellulare immortale di keratinocytes umani che ampiamente è studiata in citologia ed egualmente rappresenta un buon candidato per esplorare il potenziale di PeakForce QNM. Le celle sono state esposte ad un agente ossidativo capace dell'induzione dello sforzo. In risposta a questa aggressione chimica, le celle tendono a trasformare e sintetizzare le cosiddette fibre di sforzo dell'actina. Un'immagine tipica di media risoluzione è indicata nella figura 7.

Figura 7. immagine del Catalizzatore e di PeakForce QNM del BioScope di 75x75μm delle celle viventi di HaCat nell'ambito dello sforzo ossidativo. Le celle reagiscono rapido sintetizzando le fibrille di sforzo per stabilire i contatti con le celle adiacenti. Tali trattamenti dinamici possono anche essere tenuti la carreggiata usando questa tecnica.

In PeakForce QNM, una curva della forza è fatta per ogni pixel dell'immagine, così la risoluzione è la stessa su tutti i canali. Questo esempio illustra quanto facile e digiuna (le immagini di risoluzione del pixel 384x384 possono essere catturate in 6 - 9 minuti) è a direttamente e nel modo quantitativo una sonda cambia nella topografia e nei beni meccanici delle celle viventi in risposta ai trattamenti della droga.

AFM Sovrapponente e Canali Ottici

Un Altro delle sfide chiave correnti per le applicazioni biologiche è di potere ottenere simultaneamente informazioni del AFM ed ottiche. La funzionalità esclusiva di Registrazione e del Foglio Di Prova di Immagine del Microscopio di Bruker (MIRO™) può essere usata per includere facilmente le immagini fluorescenza/ottiche nel software di NanoScope® e per ricoprirle con le immagini del AFM. Dopo una breve calibratura, l'utente può selezionare la posizione per fare il AFM scandire. Così il campione può essere mosso automaticamente verso la posizione desiderata e l'immagine del AFM può essere pixel catturato dal pixel e completamente integrato nell'immagine ottica.

Figura 8 mostra un foglio di prova raggiunto sulle celle endoteliali viventi. L'immagine della fluorescenza (doppio macchiando DAPI per il nucleo e il á-phalloidin per i filamenti dell'actina) è fissata come i precedenti ed è sovrapposta con un'immagine del AFM fatta di una miscela di due canali: errore di punta della forza e modulo Di Young. La trasparenza è stata impostata a 50% in moda da potere fare una correlazione diretta fra le parti differenti delle celle (visibili da topografia e da fluorescenza del AFM) ed i loro beni meccanici corrispondenti (canale Di Young del AFM del modulo). In b, la c e la d l'errore di punta determinato della forza, il modulo Di Young e le immagini del AFM di deformazione sono rappresentati. Può essere veduto chiaramente nell'elasticità e canali di deformazione che sulle barriere delle celle in cui lo spessore è troppo basso, l'influenza dell'impalcatura (vetro) sui beni meccanici del campione sono non trascurabili, mentre sulla parte di memoria delle celle, il modulo Di Young medio è molto più affidabile (kPa 45,3). Per un aspetto di chiarezza, soltanto tre canali del AFM sono indicati qui, ma otto segnali differenti possono essere video simultaneamente.

Figura 8. Foglio Di Prova di fluorescenza ed immagini del AFM delle celle viventi di HUVEC create con MIRO su un Catalizzatore del BioScope. Il vantaggio principale di MIRO è di permettere simultaneamente alla visualizzazione di informazioni del AFM ed ottiche. Nel funzionare con le sonde functionalized, “un'opzione del Tiro & del Punto„ può anche essere usata per avviare esattamente la misura della forza alle posizioni desiderate senza perdere il legante.

Conclusione

Le applicazioni indicate sopra dimostrano che la Spillatura della Forza del Picco è di gran lunga il più potente e l'oggi disponibile di tecnica ad alta definizione quantitativa del AFM per sondare il prodotto chimico quantitativo ed i beni meccanici dei campioni biologici viventi con un'acquisizione accelera comparabile a TappingMode. Il numero dei beni meccanici differenti che possono essere caratterizzati supera quello di altri modi comunemente usati del AFM. Il Suo potenziale apre la strada per molte nuove applicazioni emozionanti nel campo di biologia, particolarmente nella ricerca sul cancro e nelle malattie cardiovascolari.

Circa Bruker

Le Superfici Nane di Bruker fornisce i prodotti Atomici del Microscopio della Forza/del Microscopio Sonda di Scansione (AFM/SPM) che stanno fuori da altri sistemi disponibili nel commercio per la loro progettazione e facilità di uso robuste, mentre mantenendo il più di alta risoluzione. La testa di misurazione di NANOS, che fa parte di tutti gli nostri strumenti, impiega un interferometro a fibra ottica unico per la misurazione della deformazione a mensola, che fa il compatto di impostazione così che è non più grande di un obiettivo standard del microscopio della ricerca.

Questi informazioni sono state originarie, esaminate ed adattate dai materiali forniti dalle Superfici Nane di Bruker.

Per ulteriori informazioni su questa sorgente, visualizzi prego le Superfici Nane di Bruker.

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:14

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