原子力の顕微鏡検査: PeakForce QNM を使用して生存生物的サンプルの量的なイメージ投射

AZoNano 著

目録

導入
AFM およびセル機械工
サンプル機械特性の容易な、高解像の定量化
生物的サンプルの AFM のシグナルの直接定量化
PeakForce QNM のイメージ投射生物的サンプル
リアルタイムのモニタリングのセル原動力
オーバーレイをする AFM および光学チャネル
結論
Bruker について

導入

それは生体細胞前のヴィヴォの機械特性を定めることが得られた有機体の健康を明記できるという有名な事実です。 特に力のモードに、 AFM は強力な診断および investigational ツールです。 力の分光学により少ない解像度のような多くの不利な点、獲得の速度があり、必要な定量的情報を提供しません。 PeakForce QNM は Bruker によって驚くべき使い易さの高リゾリューションで報知的なデータを提供するために開発されました。

AFM およびセル機械工

開発以来、 AFM はほぼ生理学的な条件の下でセルの観察を可能にする少数の顕微鏡検査の技術の 1 時であるという事実および TappingMode™および力の分光学の出現を用いる画像の極度の柔らかい生物的サンプルへ選択のツール、特にです。 AFM は頻繁に使用されます伸縮性がある動作およびセル移行または部関連させるために。 大部分これらの調査は TappingMode、単一力のカーブ、または力ボリューム測定に基づいています。

TappingMode は僅かな体言、摩擦およびせん断力を加える利点があり、段階イメージ投射は表面の各蛇口の間に先端とサンプルの間で散るエネルギーを反映します。 力ボリュームはユーザーが定義するポイントのマトリックスで達成される力の測定に基づくもう一つの強力な技術です。 先端とサンプル間の剛さそして付着は各力のカーブから得ることができます。 先端が興味の分子と functionalized、特定のアンバインドのイベントはまた引き込みのカーブで識別することができます。 これらのネックを克服するためには、 Bruker は PeakForce QNM を開発しました。

サンプル機械特性の容易な、高解像の定量化

PeakForce QNM はサンプルを傷つけないで生物的サンプルからの量的な nanomechanical 情報の直接抽出を可能にします。 それはプローブが同じように振動するピーク力の叩く技術に基づいて共鳴頻度 (ツールによる 1 つか 2 つの kHz) の下で TappingMode にある、しかしでずっと持っていますと同時に。 先端およびサンプルがひとつにまとめられるたびに、力のカーブは捕獲されます。 ただし、フィードバックループが TappingMode で一定した叩く振幅を維持するところピーク力のタップ制御プローブの最大ピーク力。 これらの力は低いレベルで制御され大いに接触モードよりそして TappingMode より下がることができま最も敏感な生物的サンプルの操作を許可します。

図 1 はアプローチ引き込めのサイクル、また生成された力から曲がる得ることができるすべての情報の間にプローブによって経験される異なった力フィールドを示します。 プローブはサンプル (図 1a) に近づくとき、主に毛管である引力によって表面の方に、ヴァン der Waals および静電気力はおろしました。 ポイント B で、それらの否定的な力は変調の Z 位置が最大値 (C) ポイントに達するまで先端が表面に引っ張り、サンプルに字下がりにし始めます片持梁の剛さより高くなります。 この位置はフィードバック制御のために使用される最大ピーク力値を表します。 このポイントの後で、プローブは引きポイント (また最小力に対応する) 最大付着ポイントに達するまで撤回し始めます。 それから先端は引き込み続け、通常位置 (e) に戻って達します (A) これ以上の力フィールドでように動きに影響を与えない。

図 1. PeakForce QNM の働き主義。 プローブが振動する間、力のカーブは画像の各ピクセルのために記録されます。 先端の弾道の異なった部分の間で区別するためには、この例は画像に普通幾分堅く、不完全に対応サンプル使用される TAP150A のプローブの使用によって記録されました。 生物的サンプルで、典型的なピーク力は千倍までより低くある場合もあります。

この機械工モデルは接触の主義がヘルツモデルでと変わらないが、仮定しましたり追加魅力的な相互作用を接触域 (図 2a) の外にある環の中で集中されたとと考慮します。 を考えるとそのケースでは、そして球と伸縮性がある半スペース間の接触、力は変形と下記によって関連しています:

E* が減らされたヤングの係数、 R 先端の半径および d を変形の深さ表すところ。

最終的に、先端によっておよび表面の各蛇口の間にサンプルはアプローチと引き込みのカーブ間の領域の統合によって散るエネルギー得られます。

生物的サンプルの AFM のシグナルの直接定量化

プローブが実験前に目盛りが付いている場合、上記されたすべてのシグナルは直接量的です。 この口径測定は次の通りすることができます:

  1. サンプルの堅い部分を (ガラスのように) 実行し、偏向感度が計算することができる力のカーブを記録して下さい。
  2. 「熱調子を使用して」一定したばねを撤回し、計算して下さい。
  3. 先端の半径 R. の値を得るために Tipcheck のサンプルの地形の画像を記録して下さい。
  4. 推定 R 値を入力した後、変形は選択のサンプルで調節されます。 スキャンされるべきサンプルは実験の間に調査される生物的サンプルとして同じような機械特性があるべきです。

テストされたサンプルのほとんどで非常に高リゾリューションでヤングの係数を得るのに、走査線の HSDC (高速データ収集) ファイルの捕獲によって Sneddon 適合が使用されました。 力および高さのプロフィールが比較されるとき、非望まれた部品は (力のカーブは興味ではないガラスのようなサンプルの部分で捕獲しました) 手動で除くことができます。 残存部隊のカーブは外部プログラムによって後処理される単一ファイルとしてエクスポートし平均ヤングの係数は Sneddon モデルのような異なった接触理論の、考慮によって計算することができます。

この機械理論はロードが浸透深さの正方形に比例していることを定める堅い円錐圧子 (図 2b) によって変形する伸縮性がある半スペース間の接触を考慮します。 刻み目の深さおよび先端の半径は下記によって関連付けられます:

AFM の図 2. 接触の機械工。 a では、 DMT 適合はヘルツ仮定に基づいていますが、付着力が接触域の外で集中することを示します。 これは高密度ポリマーおよび不完全に deformable サンプルによく適応します。 b では、 Sneddon 適合は柔らかく、 (生物的) deformable サンプルによく適応する無限円錐圧子として先端を考慮します。

そのようなサンプルで、 AFM のプローブの広い範囲はテストされ、勧告は図 3. に示されています。 市場の最も柔らかいあるプローブは 0.006 N/m のわずかなばねの定数があり、極度の柔らかい生体細胞を調査してこうして適切のニューロンのような OBL-B です。

ピークに力の叩くことのために推薦されるさまざまな生物的サンプルおよび対応する AFM のプローブの承諾の図 3. 範囲。 タイプによって、 eukaryotic セルは非常に異なった機械特性を表わすことができます。 ニューロンは骨細胞が細菌強い場合もある一方非常に柔らかい場合もあります (1kPa に)。 きちんとセル特性を厳密に調べるために、一定した右のばねを選んでこうして感度は必須であり。

PeakForce QNM のイメージ投射生物的サンプル

海洋の生物的サンプルは頻繁に柔らかく、堅いコンポーネントの混合物で構成されます。 アドリア海から取られた水のサンプルはスライドガラスに置かれ、 PeakForce QNM によって調査されました。 生きている珪藻植物の非常に関連した観察以外、ある細胞壁の残りはまた中断で見つけられました。 それらの構造がどのように見るか図 4 は例を与えます。 3D 地形のプロフィールは気孔が付いている独特のワッフルそっくりの構造を 100 nm および 20 nm の平均高さ明らかにします。 付着チャネルは気孔 (平均の約 50 pN) の底と細胞壁の残り間のマーク付きの対照を示します (より少なくより 20 pN)。 ただし、最も報知的なチャネルは伸縮性および変形データです。 両方のチャネルで frustule の 3 部分は顕著、はっきり異なった機械特性を表わすそれぞれです: 気孔 (~7 nm の ~300 kPa そして平均変形の平均ヤングの係数) の中心、気孔のまわりのリング (~75 kPa および ~25 nm) および中間機械特性を備えるようである細胞壁のコア部品、 (~200 kPa および ~10 nm)。

BioScope の触媒 AFM が付いている植物プランクトンの細胞壁の図 4. イメージ投射。 左上: 珪藻植物の電子顕微鏡検査の画像、デニス Kunkel、 Astrographics のサンプル礼儀。 PeakForce QNM チャネルのほとんどは驚くべき対照および高解像機能を提供します。

追加実験はエシェリヒア属大腸菌 K12 の細菌で遂行されました。 エシェリヒア属大腸菌種のほとんどとは違って、 K12 緊張は腸で増加でき、抗体に対して特に抵抗力があります。 他の特性の 1 つは普通枯渇の条件か強調の環境の下で引き込めなさいことそれらが pili を所有していることです (図 5a を見て下さい)。 今まで、イメージ投射は AFM と共に、あらゆるモードで稼働したそれらの細菌かなりの挑戦およびずっと歴史的に逃げやすい結果です。

図 5 は 1 時間以下に容易に得られるそのような生きている細菌の高解像の画像を、示します。 高さチャネル (図 5b) の 3D 表示で見ることができるように中断媒体から得、皿のそれらを広げてそれらに pili が引き込みます圧力を誘導するという事実によって説明することができる pili はもはや目に見えません。 図 5c は DMT の係数チャネルを示します。 Sneddon 適合の使用によって、平均ヤングの係数は完全に前の観察に一致させる 183 kPa であるために定められました。

PeakForce QNM 著視覚化された BioScope の触媒 AFM の図 5. エシェリヒア属大腸菌 K12 の細菌。 a では、緊張の構造は引かれます。 b では、細菌のクラスタの AFM 10x10μm の 3D 高さの表示は示されています。 c では、ヤングの係数チャネル (z スケール: 0-4GPa は) 描写されます。 これは最初にそのような細菌がずっと AFM によって視覚化された稼働している行うことです。

リアルタイムのモニタリングのセル原動力

すべての生体細胞はダイナミック、細胞骨格の足場の語順換えによる変形細胞培養の基板の広がり移行です。 それらに伴う機械変更 PeakForce QNM を使用しておよびこれらのプロセスは監視することができます。 実験の別のセットでは glioblastoma のセルを調査するのに、 PeakForce QNM が使用されました。 Glioblastoma ははるかに脳腫瘍の共通および悪性形式です。 生きている glioblastoma のセルは BioScope の触媒の PeakForce QNM およびずっと PSI の使用によって実験の時の間維持された稼働したによって視覚化されています。 この技術はユーザーが必要とされる情報によってサンプルの適当な力に非常に穏やかの、適用することを可能にします。 サンプルの非常に軽い力を、セル (glycocalyx、突起) の最上機能は加えるとき厳密に調べることができます。 血しょう膜の下にある細胞器官および細胞骨格を感じるために一方では、わずかにより高い力は必要となります。 サンプルの実質の機械特性を厳密に調べることはまた少なくとも百 nm でサンプルの刻み目を (こうして片持梁で曲げて下さい) 必要とし。 典型的な高解像の画像が適当な力 (~300 pN) を加えている間生きている glioblastoma で得た 6a ショーことを計算して下さい。

PeakForce QNM および BioScope の触媒 AFM 著生きている glioblastoma のセルの図 6. 画像。 a では、適当な力に記録される 40x40μm の高さの画像は最上および内部構造を示します。 b では、 15x15μm 地形および変形チャネルの 3D オーバーレイは示されています。 段階の定温器の潅流の Bruker の BioScope の触媒は長期実験のための生体細胞イメージ投射の最もよいバランスを提供します。

Keratinocytes は人間の皮の一番外の層の主要コンポーネントです。 そのようなセルを AFM のヘルプの研究者によって調査して皮膚癌または他の減損のプロセスを理解して下さい。

HaCat は細胞学で広く調査され、また PeakForce QNM の潜在性を探索するためによい候補者を表す人間の keratinocytes の不滅のセルラインです。 セルは圧力を誘導することができる酸化エージェント -- にさらされました。 この化学侵略に応じて、セルはいわゆるアクチンストレス・ファイバー、張線維を変形させ、総合しがちです。 典型的な中型の解像度の画像は図 7. で示されています。

図 7. 酸化圧力の下の HaCat の生存セルの 75x75μm の BioScope の触媒および PeakForce QNM の画像。 セルは急速に隣接セルが付いている接触を確立するために圧力の原繊維を総合することによって反応します。 そのような動的過程はまたこの技術の使用によって追跡することができます。

PeakForce QNM では、力のカーブは画像の各ピクセルのためになされます、従って解像度はすべてのチャネルと同じようにあります。 この例は直接にどれくらい簡単に説明し、それ (384x384 ピクセル解像度の画像は 6 から 9 分に捕獲することができます) あります絶食し、量的な方法でプローブは薬剤の処置に応じて生体細胞の地形そして機械特性で変更します。

オーバーレイをする AFM および光学チャネル

生物的アプリケーションのための現在の主挑戦の別のものは同時に光学および AFM 情報に得られますです。 Bruker の排他的な顕微鏡の画像登録およびオーバーレイ (MIRO™) 機能が容易に光学/蛍光性の画像を NanoScope® のソフトウェアにインポートし、 AFM の画像との上にあるのに使用することができます。 短い口径測定の後で、ユーザーは AFM をスキャンさせます位置を選ぶことができます。 従ってサンプルは望ましい位置に自動的に移動し、 AFM の画像はピクセルによって光学画像に十分に統合されて捕獲されたピクセル行い。

図 8 は生存 endothelial セルで達成されるオーバーレイを示します。 蛍光性の画像は背景として (アクチンフィラメントの核そして á-phalloidin のための DAPI を二重汚します) セットされ、 2 つのチャネルの組合せのなされる AFM の画像と重複します: ピーク力のエラーおよびヤングの係数。 過透性は 50% で直接的な相関関係がセルの異なった部分 (AFM の地形および蛍光性によって目に見える) および対応する機械特性 (ヤングの係数 AFM チャネル) の間で作ることができるようにセットされました。 b では、 c および d 個々のピーク力のエラー、ヤングの係数および変形 AFM の画像は表されます。 それは伸縮性ではっきり見ることができ、セルのコア部品で、平均ヤングの係数がはるかに信頼できる一方厚さが余りに低いセルの端で、サンプルの機械特性の足場 (ガラス) の影響非僅かである変形チャネル、 (45.3 kPa)。 明快さの問題のために、 3 つの AFM チャネルだけここに示されています、 8 つのシグナルは同時に表示することができます。

蛍光性の図 8. オーバーレイおよび BioScope の触媒の MIRO と作成される生存 HUVEC のセルの AFM の画像。 MIRO の主要な利点は光学および AFM 情報の表示を同時に可能にすることです。 functionalized プローブと作動するとき正確に配位子を失わないで望ましい位置で力の測定を誘発するのに、また 「ポイント及びシュート」オプションが使用することができます。

結論

上で示されているアプリケーションはピーク力の叩くことがはるかに最も強力であり、獲得を用いる生存生物的サンプルの量的な化学薬品そして機械特性を厳密に調べる量的な高解像 AFM の技術の使用できる今日が TappingMode との対等促進することを示します。 特徴付けることができる異なった機械特性の番号は他の広く使われた AFM のモードのそれを超過します。 その潜在性は癌研究および心循環器疾患の生物学のフィールドの多くの刺激の新規アプリケーションのための道を、特に開きます。

Bruker について

Bruker の Nano 表面は強いデザインおよび使い易さのための他の商用化されたシステムから際立っている原子力の顕微鏡/スキャンのプローブの顕微鏡 (AFM/SPM) の製品を提供します、間高リゾリューションを維持する。 すべての私達の器械の部品である NANOS 測定ヘッドはこと標準研究の顕微鏡の目的より大きくないセットアップコンパクトをそう作る片持梁偏向を測定するための一義的な光ファイバーの干渉計を用います。

この情報は Bruker の Nano 表面によって提供される材料から供給され、見直され、そして適応させて。

このソースのより多くの情報のために、 Bruker の Nano 表面を訪問して下さい

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:15

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