基本强制显微学: 居住的生物范例定量想象使用 PeakForce QNM 的

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简介
AFM 和细胞机械工
范例机械性能的容易,高分辨率量化
AFM 信号的直接量化在生物范例的
与 PeakForce QNM 的想象生物范例
监控细胞动力在实时
覆盖的 AFM 和光学通道
结论
关于 Bruker

简介

它是一个著名的情况确定活细胞前体内机械性能可能指示他们被提取的有机体的健康。 特别地在强制模式, AFM 是一个强大的诊断和调查工具。 强制分光学有很多缺点例如较少解决方法,购买的速度,并且它不提供需要的定量信息。 PeakForce QNMBruker 开发 提供 情报 数据 在 与 卓越 的 易用 的 高 分辨率 。

AFM 和细胞机械工

从其发展, AFM 是选择工具对图象超级软的生物范例,特别是与 TappingMode™和强制分光学和这个情况诞生它是在近生理情况下允许细胞观察少数个显微学技术的之一。 AFM 是常用的关联有弹性工作情况和细胞迁移或者部门。 绝大多数这些研究在 TappingMode、单一强制曲线或者强制数量评定基础上。

TappingMode 提供 应用 微不足道 的 名词性 的 词 、 摩擦 和 剪切力 的 好处 , , 并且 阶段 想象 反射 这 个 能源 被消散 在 这 个 技巧 和 这 个 范例 之间 在 在 表面 的 每 轻拍 期间 。 强制数量是在强制评定基础上的另一个强大的技术达到在这个用户定义的点矩阵。 僵硬和黏附力在这个技巧和这个范例之间可以从每强制曲线被提取。 万一这个技巧 functionalized 与分子利益,特定断开的活动在收缩曲线可能也被识别。 要解决这些瓶颈, Bruker 开发 PeakForce QNM

范例机械性能的容易,高分辨率量化

PeakForce QNM 启用定量 nanomechanical 信息的直接提取从生物范例的,无需损坏这个范例。 它有根据高峰强制开发的技术,在期间探测相似地摆动,当它在 TappingMode,但是在远低于共鸣频率 (1 或 2 kHz 根据工具)。 每次这个技巧和这个范例被带来,强制曲线被获取。 然而 , 其中 反馈 环路 维护 这 个 开发 的 高度 恒定 在 TappingMode , 高峰 强制 开发 的 控制 在 探测 的 最大 高峰 强制 。 这些强制低于联系模式可以是受控的在级别和甚而低于 TappingMode 允许在甚而最精美的生物范例的运算。

图 1 显示探测体验的不同的力场在途径缩回循环,以及可以从被生成的强制被提取弯曲的所有信息时。 当 探测 处理 这 个 范例 (图 1a ) 时 , 它 拉下 往 表面 由 吸引力 , 主要 血丝 , 范 der Waals 和 静电力 。 在 点 B , 那些 负 强制 高于 悬臂 的 僵硬 成为 , 造成 这 个 技巧 拉 到 表面 然后 开始 缩进 到 这 个 范例 , 直到 模块化 的 Z 位置 到达 其 最大 数量 (点 C) 。 此位置表示最大高峰强制值,为反馈控制使用。 在此点以后,探测开始让步,直到它到达驶离点 (最大黏附力点,也对应于最小的强制)。 然后这个技巧持续缩回并且到达回到其原始位置 (e) (在 A) 没有其他力场不影响其行动。

图 1. PeakForce QNM 工作原理。 当探测摆动时,强制曲线为这个图象的每象素被记录。 通过使用 TAP150A 探测,要区分技巧弹道之间的区别部分,此示例被记录,典型地使用对相当僵硬的图象和恶劣兼容范例。 在生物范例,典型的高峰强制可以至一千次更低。

此机械工设计假设,联络原则在这个赫兹波的设计依然是同一样,但是考虑另外的有吸引力的交往集中在环体里面位于在联系范围 (图 2a) 外面。 在该案件和就在范围和有弹性半空格之间的联络而论,强制与变形有关:

那里 E* 表示这个减少的年轻的模数、 R 技巧半径和 d 变形深度。

最终 , 这 个 技巧 消散 的 这 个 能源 和 这 个 范例 在 在 表面 的 每 轻拍 期间 通过 集成 在 这 个 途径 和 收缩 曲线 之间 的 区 得到 。

AFM 信号的直接量化在生物范例的

当探测在这个实验之前被校准,以上提到的所有信号将直接地是定量的。 此定标可以完成如下:

  1. 从事这个范例的一个僵硬的部分 (象玻璃) 并且记录偏转灵敏度可以被计算的强制曲线。
  2. 提取并且计算弹簧恒定使用 “热量声调”。
  3. 记录 Tipcheck 范例的地势图象得到技巧半径 R. 的值。
  4. 在输入估计的 R 值以后,变形在选择范例被调整。 将浏览的这个范例应该有相似的机械性能作为在这个实验期间,将调查的生物范例。

在大多被测试的范例,获取在扫描线的一个 HSDC (高速数据捕获) 文件用于 Sneddon 适应提取这个年轻的模数在非常高分辨率。 当强制和高度配置文件被比较时,非希望的零件 (强制曲线在不是利益范例的部分获取了,例如玻璃) 可以手动地被排除。 残存部队曲线可以被导出作为一个单一文件,后加工由外部程序,并且平均年轻的模数可以通过考虑不同的联络原理计算,例如 Sneddon 设计。

此机械原理考虑在严格的圆锥形受托代购商扭屈的有弹性半空格之间的联络 (图 2b),确定负荷与有效肤深的正方形是按比例。 凹进深度和技巧半径涉及:

图 2. AFM 的联络机械工。 在 a, DMT 适应根据赫兹波的假设,但是阐明,黏附力强制在联系范围之外集中。 这很好适应高密度聚合物和恶劣可变性的范例。 在 b, Sneddon 适应这个技巧把无限圆锥形受托代购商视为,很好适应软 (生物) 和可变性的范例。

在这样范例,各种各样的 AFM 探测被测试了,并且这个推荐标准在表 3. 产生。 在这个市场上的最软的现有的探测是 OBL-B,有 0.006 N/m 一个名义上的弹簧常数并且因而是适当调查超级软的活细胞,例如神经元。

图 3. 多种生物范例和对应的为高峰强制开发建议使用的 AFM 探测标准范围。 根据他们的类型,真核状态的细胞可能陈列非常不同的机械性能。 神经元可以非常软 (下来对 1kPa),而骨细胞可以是一样稳健的象细菌。 为了适当地探查细胞属性,选择恒定正确的弹簧和因而区分是必须的。

与 PeakForce QNM 的想象生物范例

海洋生物范例由软和严格的要素混合物经常组成。 从亚得里亚海拿取的水范例在一个载玻片上把放并且由 PeakForce QNM 调查。 除非常在生存硅藻的相关观察之外,一些细胞壁残余在暂挂也被找到。 图 4 举一个例子那些结构如何查找。 3D 地势配置文件在大小上显示与毛孔的一个典型象奶蛋烘饼的结构 100 毫微米和一个平均高度 20 毫微米。 黏附力通道显示在毛孔 (大约 50 pN 的底层在平均数) 和细胞壁的其余的之间一个明显对比 (少于 20 pN)。 然而 , 最 情报 的 通道 是 弹性 和 变形 数据 。 在两条通道上 frustule 的三个部分是著名的,陈列明显地不同的机械性能的其中每一: 毛孔 (~300 kPa 和平均变形的平均年轻的模数的中心 ~7 毫微米),在毛孔附近的环形 (~75 kPa 和 ~25 毫微米) 和细胞壁的核心零件,似乎有半成品机械性能 (~200 kPa 和 ~10 毫微米)。

图 4. 浮游植物有电影放映机催化剂的 AFM 细胞壁想象。 最左上侧: 硅藻 的 电子 显微镜 术 图象 , 丹尼斯 Kunkel , Astrographics 抽样 礼貌 。 大多 PeakForce QNM 通道提供一个卓越的对比和高分辨率功能。

另外的实验在大肠埃希氏菌 K12 细菌被执行了。 不同 于 大多数 大肠 埃希氏菌 种类 , K12 张力 能 倍增 在 肚腑 并且 对 抗体 是 特别 有 抵抗性 。 他们的一个其他特性是他们拥有 pili (参见图 5a) 请典型地缩回在取尽情况或所有强调的环境下。 直到现在,想象那些细菌运行与 AFM,在所有模式下,是一个严重的挑战和一个历史上逃避结果。

图 5 在少于一时数显示的这样生存细菌,容易地得到的高分辨率图象。 在高度通道 (图 5b) 的 3D 表示能被看见, pili 不再是可视的,可以用这个情况解释提取从他们的暂挂媒体和分布他们在盘导致造成那些 pili 缩回的重点。 图 5c 显示 DMT 模数通道。 通过使用 Sneddon 适应,确定平均年轻的模数是 183 kPa,完全符合早先观察。

在电影放映机催化剂 AFM 的图 5. 大肠埃希氏菌 K12 细菌印象 PeakForce QNM。 在 a,画张力的结构。 在 b,细菌字符串的 AFM 10x10μm 3D 高度表示显示。 用 c,年轻的模数通道 (z 缩放比例: 0-4GPa) 表示。 这第一次是这样细菌印象运行由 AFM。

监控细胞动力在实时

所有活细胞是动态,改变形状由于他们的细胞骨架绞刑台的重新整理和分布和移居在细胞培养基体。 随附于他们使用 PeakForce QNM的这些进程和机械更改可以被监控。 在另一条实验装置, PeakForce QNM 用于调查 glioblastoma 细胞。 Glioblastoma 显然是脑癌的最公用和最恶性的表单。 生存 glioblastoma 细胞 由 在 电影 放映机 催化剂 的 PeakForce QNM 和 被维护 的 运行 是 印象 的 在 这 个 实验 的 时期 使用 PSI 。 此技术允许这个用户适用一非常柔和于在这个范例的中等强制,根据需要的信息。 当应用在这个范例时的非常轻的强制,这个细胞 (蛋白质复合物,伸进) 的最上面的功能可以被探查。 另一方面,要求轻微更强的强制感觉在质膜下和这个细胞骨架位于的细胞器。 探查这个范例的实际机械性能由一至少一百毫微米也要求这个范例的凹进 (和请因而屈曲在悬臂)。 图 6a 一个典型的高分辨率图象在生存 glioblastoma 获得,当应用中等强制时的显示 (~300 pN)。

图 6. 生存 glioblastoma 细胞图象 PeakForce QNM 和电影放映机催化剂 AFM。 在 a, 40x40μm 高度图象被记录在中等强制显示最上面和内部结构。 在 b,地势和变形通道 15x15μm 3D 重叠显示。 Bruker 的与喷洒阶段孵养器的电影放映机催化剂提供活细胞想象最佳的平衡长期实验的。

Keratinocytes 是人力皮肤的最外层的层的主要元件。 学习这样细胞由 AFM 帮助研究员了解皮肤癌或其他损伤的进程。

HaCat 是在细胞学方面广泛调查并且表示一名好候选人测试 PeakForce QNM 潜在人力 keratinocytes 的不朽的细胞系。 细胞显示了在一氧化作用者能够导致重点。 以回应此化工侵略,细胞倾向于变换和综合所谓的肌动蛋白压力纤维。 一个典型的媒体解决方法图象在表 7. 显示。

图 7. 75x75μm 电影放映机居住的 HaCat 细胞的催化剂和 PeakForce QNM 图象在氧化重点下的。 细胞通过迅速综合重点原纤维设立与相邻细胞的联络起反应。 通过使用此技术,这样动态过程可能也被跟踪。

PeakForce QNM,强制曲线为这个图象的每象素做,因而这个解决方法在所有通道上相同。 此示例说明得多么容易并且斋戒 (384x384 象素解决方法图象可以在 6 到 9 分钟之内被获取) 它是对直接地,并且以一个定量方式探测在地势和活细胞机械性能更改以回应药物处理。

覆盖的 AFM 和光学通道

别的生物应用的当前关键挑战是能同时获得光学和 AFM 信息。 Bruker 的独有的显微镜图象注册和重叠 (MIRO™) 功能可以用于容易地导入光学/荧光图象到 NanoScope® 软件和躺在他们与 AFM 图象。 在短的定标以后,这个用户能选择这个地点做 AFM 浏览。 因而这个范例可以自动地被移动向这个期望位置,并且 AFM 图象可以是被获取的象素由象素和充分地集成光学图象。

图 8 显示在居住的内皮细胞的细胞达到的重叠。 荧光图象 (二重弄脏中坚力量和 á-phalloidin 的 DAPI 肌动蛋白细丝的) 被设置作为这个背景并且与 AFM 图象重叠做二条通道的混合: 高峰强制错误和年轻的模数。 这种透明度被设置了在 50%,以便正相关可以做细胞的区别部分 (可视由 AFM 地势和荧光) 和他们对应的机械性能 (年轻的模数 AFM 通道) 之间。 在 b, c 和 d 单个高峰强制错误,年轻的模数和变形 AFM 图象表示。 在弹性能明显地被看见,并且在细胞边缘这个厚度是太低的,这个绞刑台的变形通道 (玻璃) 影响对这个范例机械性能是非微不足道的,而在细胞的核心零件,平均年轻的模数是可靠 (45.3 kPa)。 对于清晰问题,仅三条 AFM 通道显示得这里,但是八个不同信号可以同时被显示。

图 8. 荧光重叠和用 MIRO 创建的居住的 HUVEC 细胞的 AFM 图象在电影放映机催化剂。 MIRO 的主要福利是同时启用光学和 AFM 信息显示。 当运行与 functionalized 探测时, “点 & 射击”选项可能也用于在期望地点准确地触发强制评定,无需丢失这个配合基。

结论

显示的应用以上显示出,峰顶强制开发显然是最强大的,并且定量高分辨率探查 AFM 技术可用的今天定量化学制品和居住的生物范例机械性能与购买的加速可比较与 TappingMode。 可以被分析不同的机械性能的数量超出那其他常用的 AFM 模式。 其潜在铺平道路许多令人激动的新建应用程序的在生物领域,特别是在癌症研究和心血管疾病。

关于 Bruker

Bruker 纳诺 表面 提供 从 他们 的 稳健 设计 和 易用 的 其他 商业 可用 的 系统 引人注意 , , 维护 最 高 分辨率 的 基本 强制 显微镜 / 扫描 探测 显微镜 (AFM/SPM ) 产品 。 NANOS 评定的题头,是所有我们的仪器的一部分,使用评定的悬臂式偏折一台唯一光导纤维的干涉仪,如此做设置协定它大于一个标准研究显微镜目的没有。

此信息是来源,复核和适应从 Bruker 纳诺表面提供的材料。

关于此来源的更多信息,请参观 Bruker 纳诺表面。

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:03

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