Behandelte Themen
Hintergrund
Teilchengrößenbestimmung durch statische Lichtstreuung
Voraussetzungen für das Molekulargewicht Messungen
Ergebnisse
Polymers
Polysaccharide
Schlussfolgerungen
Hintergrund
Der Zetasizer Nano-System verbindet dynamische, statische und elektrophoretischen Lichtstreuung Technologien, die für die Messung der Partikelgröße, Zetapotential und Molekulargewicht.
Teilchengrößenbestimmung durch statische Lichtstreuung
Statische Lichtstreuung (SLS) ist eine nicht-invasive Technik zur Charakterisierung von Makromolekülen in Lösung verwendet. Ein Strahl von monochromatischem Licht durch eine Probe gerichtet und die Intensität des Lichts in einem Winkel von 173 ° von den Molekülen gestreut wird gemessen. SLS nutzt die zeitlich gemittelte Intensität des gestreuten Lichts, aus denen das Gewicht Molekulargewicht und zweiten Virialkoeffizienten bestimmt werden können.
Die Intensität des gestreuten Lichts, dass ein Makromolekül erzeugt, ist proportional zum Produkt des Gewichts Molekulargewicht und die Konzentration des Makromoleküls. Für Moleküle, die keine Winkelabhängigkeit in ihrer Streuung zeigen, ist die Beziehung zwischen der Intensität des gestreuten Lichts und deren Molekulargewicht durch die Rayleigh-Gleichung gegeben:
wo K eine optische Konstante, R θ ist der Rayleigh-Verhältnis des gestreuten zur einfallenden Lichtintensität, ist M das Gewicht des Molekulargewichts, A 2 ist die zweite Virialkoeffizienten und C ist die Konzentration der Probe.
Daher ist ein Grundstück von KC / Rθ gegenüber C ist zu erwarten, dass linear mit einem Intercept-äquivalent zu 1 / M und einer Steigung gleich dem zweiten Virialkoeffizienten A 2. Eine solche Handlung ist als Debye Plot bekannt.
Die zweiten Virialkoeffizienten ist eine Eigenschaft beschreibt die Stärke der Wechselwirkung zwischen dem Molekül und Lösungsmittel. Für Proben, bei denen A 2> 0, neigen die Moleküle in Lösung bleiben. Wenn A 2 = 0, ist das Molekül-Lösungsmittel Stärke der Wechselwirkung entspricht dem Molekül-Molekül-Wechselwirkungen Stärke und das Lösungsmittel wird als ein Theta Lösungsmittel beschrieben. Wenn A 2 <0, wird der Moleküle neigen zur Kristallisation oder Aggregat.
Weitere Einzelheiten der Theorie der Molekulargewichtsbestimmungen durch statische Lichtstreuung kann in anderen Applikationsschrift von der gefunden werden Malvern Instruments Website.
Diese Application Note Details Molekulargewicht Messungen an verschiedenen Proteine, Polymere und Polysaccharide auf die durchgeführten Zetasizer Nano .
Voraussetzungen für das Molekulargewicht Messungen
- Zetasizer Nano S oder ZS (Instrumente, beinhalten NIBS ™ Optik)
- Quarzküvette
- Vorbereitung einer Reihe von Konzentrationen der unbekannten Molekül (Protein oder Polymer) in einem geeigneten Lösungsmittel
- Bestimmung der differentiellen Brechungsindexinkrement (dn / dc). Dies kann entweder aus der Literatur Quellen gefunden werden oder mit Hilfe eines geeigneten Refraktometer. Der dn / dc-Wert für globuläre Proteine, zum Beispiel, ist 0.185ml / g
- Die Messung der Intensität der Streuung von einer Standard-Probe, deren Rayleigh-Verhältnis bekannt ist. Dies wird empfohlen, zu Toluol als der Wert bei verschiedenen Wellenlängen bekannt ist. Zum Beispiel ist die Rayleigh-Verhältnis von Toluol bei 633nm 1,3522 x 10 -5 cm -1
- Die Messung der Intensität der Streuung von der Konzentration Null-Probe (wenn das Lösungsmittel unterscheidet sich von Toluol)
- Die Messung der Intensität der Streuung durch die verschiedenen Konzentrationen der Probe
Es wird darauf hingewiesen, dass die zu Zetasizer Nano -Software die Intensitäten des gestreuten Lichts der vorbereiteten Proben Maßnahmen und berechnet automatisch das Molekulargewicht und die zweiten Virialkoeffizienten von Daten mit Hilfe einer Debye Plot.
Ergebnisse
Polymers
Abbildung 1 zeigt die einzelnen Winkel Debye Plots für eine Reihe von Polystyrol-Standards vorbereitet in Toluol gemessen und auf einem Zetasizer Nano S. Die gemessenen Molekulargewichte und zweiten Virialkoeffizienten (A 2), zusammen mit bekanntem Molekulargewicht Werte, in gegeben werden Tabelle 1 aufgeführt. In jedem Fall wurde der dn / dc-Wert getroffen werden, um 0.110ml / g.
Abbildung 1. Debye Plots für verschiedene Polystyrolpolymere.
Tabelle 1. Molekulargewichte und zweiten Virialkoeffizienten (A2) von verschiedenen Polystyrolpolymere in Toluol hergestellt
| | | |
Probe A | 1,08 | 0,980 | -2.37x10 -2 |
Probe B | 9,865 | 9,86 | 17.51x10 -4 |
Probe C | 102 | 96 | 8.25x10 -4 |
Wie in der Tabelle der Ergebnisse zeigt, sind die berechneten Molekulargewichte stimmen mit den bekannten Werten.
Die Steigungen von jeder Parzelle (die zweite Virialkoeffizienten) variieren von positiven (9.9KDa Polystyrol) zu negativen (980Da Polystyrol-Standard). Die positive zweiten Virialkoeffizienten darauf hinweist, dass die Wechselwirkungsenergie zwischen den einzelnen Polymer und dem Lösungsmittel stärker als die Wechselwirkungsenergie zwischen dem Polymer und sich selbst ist. Während der negativen zweiten Virialkoeffizienten zeigt an, dass die Polymermoleküle nicht wie Toluol als Lösungsmittel.
Polysaccharide
Die Debye Plot aus einer Stichprobe von Dextran in Wasser erhalten wird in Abbildung 2 dargestellt. Die Probe hatte eine gemeldete Molekulargewicht von 68KDa und das Gewicht des Molekulargewichts aus der Messung erhalten wurde 63.3KDa. A dn / dc-Wert von 0.140ml / g wurde für die Messungen verwendet.
Abbildung 2. Debye Plot für Dextran in Wasser.
Die Nano-Software ermöglicht das Speichern von Partikelgrößenverteilung Daten mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung sowie die absolute Messung der Intensität für das Molekulargewicht Analyse. Dies ermöglicht die Bestimmung der Modalität der Probe vor dem Molekulargewicht Messung. Dies ist bei der Bestimmung der Reinheit der Proben vor der Analyse wichtig. Abbildung 3 ist die Intensität Größenverteilung aus dem Bestand Konzentration der Dextran-Lösung (10mg/ml) erhalten. Die Probe hatte eine zaverage Durchmesser (der mittlere Durchmesser von der Intensität des gestreuten Lichts basiert) von 13,5 nm. Die monomodale Verteilung erhalten wird bestätigt, dass es keine Aggregate zu präsentieren. Das Molekulargewicht von Lichtstreuung gewonnen wird gewichtsgemittelten und somit das Vorhandensein von Aggregaten wird auf diesen Wert beitragen.
Abbildung 3. Intensity Größenverteilung von Dextran in Wasser (10mg/ml).
Die z-mittleren Durchmesser von 13,5 nm kann verwendet werden, um ein geschätztes Molekulargewicht von 64.8KDa mit einer empirischen Eichkurve von Malvern Instruments entwickelt berechnen. Das Molekulargewicht Schätzung ist im Nano-Software und ist nützlich für die Überprüfung der experimentellen Daten erhalten.
Schlussfolgerungen
Der Zetasizer Nano ist der einzige kommerzielle Instrument zur Messung der Größe, Zetapotenzial und Molekulargewicht in einem einzigen, kompakten Gerät. Der Einbau von NIBS ™ Optik gibt die Empfindlichkeit für die Messung von sehr kleinen, schwach streuenden Proben und die Bestimmung des Molekulargewichts erforderlich. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Backscatter-Erkennung die Messung der Konzentration, opake Proben ohne Verdünnung.
Quelle: "Molekulargewichtsbestimmungen des Polymers und Polysaccharide mit der Zetasizer Nano System", Application Note von Malvern Instruments.
Für weitere Informationen über diese Quelle besuchen Sie bitte Malvern Instruments Ltd (UK) oder Malvern Instruments (USA) .