Proteine Schmelzpunkt-Kennzeichnung Unter Verwendung der Nano-Anlage Zetasizer Von Malvern-Instrumenten

Themen Umfaßt

Hintergrund
Denaturierung von Proteinen
Dynamische Lichtstreuung für Kennzeichnung von Proteinen
Der Protein-Schmelzpunkt
Faktoren, die den Schmelzpunkt von Proteinen Beeinflussen
Die Nano-Anlage Malvern Zetasizer

Hintergrund

Proteine werden aus Polypeptidketten verfasst, synthetisiert innerhalb der Zelle von einem Pool von 20 verschiedenen Aminosäurebaumustern. Im Gegensatz zu biologischen Polymeren des künstlichen und gelegentlichen Ringes werden die Polypeptidketten des Proteins in eindeutige 3 Maßzellen im natured Zustand gefaltet. Diese Zellen werden durch eine Kombination der elektrostatischen und hydrophoben Interaktionen, zusammen mit der Entstehung von mehrfachen Wasserstoffanleihen zwischen den Seitenketten der Aminosäuren innerhalb der Zelle stabilisiert.

Denaturierung von Proteinen

Proteine wurden entwickelt, um spezielle Funktionen innerhalb der biologischen Anlagen, wie Katalysierung von Reaktionen und Transportieren von kleinen Molekülen oder von Ionen durchzuführen. Diese Funktionalität erfordert einen großen Grad an Flexibilität innerhalb der Zelle des Proteins. Als solches sind die Interaktionen, welche die Proteinzelle stabilisieren, gerade genügend, die Zelle innerhalb eines schmalen Bereiches der Umweltbedingungen beizubehalten. Wenn Lösungszustände außerhalb dieser Reichweite, z.B. durch eine Änderung im pH oder in der Temperatur sind, können entropically getriebene Denaturierung oder Ausbreiten schnell auftreten. Wenn Denaturierung auftritt, wird das kleine des Proteins auf einen Wert erhöht, der mit einem gelegentlichen Ringpolymer des gleichen Molekulargewichtes in Einklang ist. In Ermangelung der chaotropic (die verbietende Anhäufung) Agenzien Interpolymer können hydrophobe Interaktionen zu unspezifische Anhäufung der denaturierten Polypeptidketten schnell führen. Eine Darstellung des Denaturierungsprozesses, zusammen mit der nachfolgenden Änderung an Größe wird in Abbildung 1. gezeigt.

Abbildung 1. Diagramm, das den Proteindenaturierungsprozeß und die nachfolgende Änderung in der hydrodynamischen Größe angezeigt durch den Durchmesser des festen Kreises einzeln aufführt.

Dynamische Lichtstreuung für Kennzeichnung von Proteinen

Die Dynamische Lichtstreuung (DLS) ist lang als Proteinkennzeichnungshilfsmittel verwendet worden. In DLS wird die Brownische Bewegung der Partikel gemessen, und die hydrodynamische Größe wird unter Verwendung der Schüren-Einstein-Gleichung berechnet. Die Empfindlichkeit von DLS ist genügend, verschiedene Oligomere und quaternäre Proteinzustände zu unterscheiden und wird ideal für das Überwachen der Stabilität der Proteinzelle zur Denaturierung von Bedingungen entsprochen.

Der Protein-Schmelzpunkt

Der Proteinschmelzpunkt (TM) wird als die Temperatur definiert, bei der das Protein denaturiert. Die Änderung an Größe, die die Proteindenaturierung begleitet, wird leicht unter Verwendung DLS-Techniken gekennzeichnet. Betrachten Sie Abbildung 2 zum Beispiel, die der Temperatur abhängigen Z-Durchschnittlichen Durchmesser und Zerstreuenintensität für Ovalbumin in phosphatgepuffertem salzigem gemessen (PBS) mit einem Zetasizer Nano-ZS zeigt. Bei den Temperaturen sind kleiner als 71°C, die Größe und die Zerstreuenintensität die Konstante und schlagen eine stabile tertiäre Zelle vor. An 71°C und höher, die Größe und Intensitätszunahme mit der Temperatur exponential zerstreuen, das Vorhandensein von denaturierten Gesamtheiten anzeigend.

Abbildung 2. Schmelzpunktspur und -hysterese für Ovalbumin in PBS.

Faktoren, die den Schmelzpunkt von Proteinen Beeinflussen

Wegen der eindeutigen primären Folge von den Aminosäuren, die mit spezifischen Proteintypen verbunden sind, können sich Schmelzpunkte beträchtlich unterscheiden. Lösungen klimatisiert, z.B. pH und Salzkonzentration und gibt Übersetzungsmodifikationen bekannt, kann z.B. Glycosylation, einen markierten Einfluss auf die Stabilität der Proteinzelle und folglich der Schmelztemperatur auch haben. Schmelzpunktmaße sind dann ein wichtiger Schritt in der Gesamtkennzeichnung des Zielproteins, besonders wenn das Protein für Integration in ein Arzneimittel oder in eine Formulierung bestimmt ist. Abbildung 3 zeigt die Schmelzpunktspuren für eine Reihe Proteine in PBS. Die automatisierten Maße wurden mit einem Zetasizer Nano-ZS, unter Verwendung einer Inkrementalrampe der temperatur 1°C und einer winzigen Zeit des Gleichgewichts 3 bei jeder Maßtemperatur montiert.

Abbildung 3. Schmelzpunktspuren und TM-Werte für eine Reihe Proteine in PBS.

Die Nano-Anlage Malvern Zetasizer

Das Zetasizer Nano-ZS von Malvern-Instrumenten ist das erste Kreditpapier der Privatwirtschaft, zum der Kleinteile und der Software für die kombinierten dynamischen, statischen und elektrophoretischen Lichtstreuungsmaße zu umfassen und gibt dem Forscher eine große Auswahl von Beispieleigenschaften, einschließlich die Größe, das Molekulargewicht und das Zetapotential. Die Anlage wurde speziell konstruiert, um die niedrige Konzentration und die Probenmengenbedingungen zu erfüllen, die gewöhnlich mit den pharmazeutischen und biomolekularen Anwendungen, zusammen mit den Anforderungen der hohen Konzentration für kolloidale Anwendungen verbunden sind. Diese eindeutige Mischung von Anforderungen Zufriedenzustellen war über die Integration einer optischen Rückstreuanlage und der Auslegung einer neuen Zellkammer erreicht. Als Folge dieser Merkmale überschreiten die Nano-ZS Bedingungen Zetasizer für Stichprobengröße und die Konzentration die für jedes andere handelsübliche DLS-Instrument, mit einer Größenreichweite 0.6nm zu 6um und einen Konzentrationsbereich des Lysozyms 0.1mg/mL zu 40% W/V. Als hinzugefügte Prämie sind die Nano-ZS Kleinteile Zetasizer das optimierende Selbst, und die Software umfaßt eine eindeutige Maßnahme „mit einen Klicks“, analysiert und berichtet über das Merkmal, das konstruiert wird, um die neue Benutzerlernkurve herabzusetzen.

Date Added: May 9, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:25

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