Caractérisation de Point de Fusion de Protéines Utilisant le Système Nano de Zetasizer des Instruments de Malvern

Sujets Couverts

Mouvement Propre
Dénaturation des Protéines
Dispersion de la Lumière Dynamique pour la Caractérisation des Protéines
Le Point de Fusion de Protéine
Facteurs Concernant le Point de Fusion des Protéines
Le Système de Nano de Malvern Zetasizer

Mouvement Propre

Des Protéines se composent de réseaux de polypeptide, synthétisé dans la cellule d'une piscine de 20 types acides aminés différents. Contrairement aux polymères biologiques de bobine fabriquée par l'homme et irrégulière, les réseaux du polypeptide de la protéine sont pliés dans de seules structures à trois dimensions dans la condition natured. Ces structures sont stabilisées par une combinaison des interactions électrostatiques et hydrophobes, avec la formation des liaisons hydrogènes multiples entre les chaînes latérales des acides aminés dans la structure.

Dénaturation des Protéines

Des Protéines ont été évoluées pour remplir des fonctionnements particuliers dans des systèmes biologiques, tels que catalyser des réactions et transporter des petites molécules ou des ions. Cette fonctionnalité rend nécessaire un grand degré de souplesse dans la structure de la protéine. En soi, les interactions stabilisant la structure des protéines sont simplement suffisantes pour mettre à jour la structure dans une marge étroite des conditions environnementales. Si les états de solution sont en dehors de ce domaine, par exemple par un changement du pH ou de la température, la dénaturation ou le déploiement entropically pilotée peut rapidement se produire. Quand la dénaturation se produit, la petite taille de la protéine est grimpée jusqu'à une valeur compatible avec du polymère irrégulier de bobine du même poids moléculaire. Faute de (totalisation interdisant) agents chaotropic, les interactions hydrophobes d'inter-polymère peuvent rapidement mener à la totalisation non spécifique des réseaux dénaturés de polypeptide. Une représentation du procédé de dénaturation, avec la modification ultérieure dans la taille est affichée sur le Schéma 1.

Le Schéma 1. Schéma détaillant le procédé de dénaturation de protéine et le changement ultérieur de la taille hydrodynamique indiquée par le diamètre du cercle solide.

Dispersion de la Lumière Dynamique pour la Caractérisation des Protéines

La dispersion de la lumière Dynamique (DLS) a été longtemps utilisée comme outil de caractérisation de protéine. Dans DLS, le mouvement Brownien des particules est mesuré, et la taille hydrodynamique est prévue utilisant l'équation de Charger-Einstein. La sensibilité de DLS est suffisante pour discerner différentes conditions oligomères et quaternaires de protéine, et approprié idéalement à surveiller la stabilité de la structure des protéines à dénaturer des conditions.

Le Point de Fusion de Protéine

Le point de fusion de protéine (TM) est défini comme température à laquelle la protéine dénature. La modification dans la taille qui accompagne la dénaturation de protéine est facilement recensée utilisant des techniques de DLS. Considérez le Chiffre 2 par exemple, qui affiche à la température le diamètre Z-Moyen dépendant et intensité de dispersion pour l'Ovalbumine dans saline tamponné aux phosphates (PBS) mesuré avec un Nano ZS de Zetasizer. Aux températures moins que 71°C, la taille et l'intensité de dispersion sont constante, suggérant une structure tertiaire stable. 71°C et plus élevé, la aux deux la taille et disperser l'augmentation d'intensité exponentiellement avec la température, indiquant la présence des agrégats dénaturés.

Le Schéma 2. trace et hystérésis de point de Fusion pour l'Ovalbumine dans PBS.

Facteurs Concernant le Point de Fusion des Protéines

À cause de la seule séquence primaire des acides aminés associés avec les types particuliers de protéine, les points de fusion peuvent différer de manière significative. Les Solutions révise, par exemple pH et concentration en sel, et inscrit des modifications de translation, par exemple la glycosylation, peut également avoir une influence marquée sur la stabilité de la structure des protéines et par conséquent de la température de fonte. Les mesures de point de Fusion sont alors une étape importante dans toute la caractérisation de la protéine cible, en particulier si la protéine est destinée à l'intégration dans un produit pharmaceutique ou une formulation. Le Schéma 3 affiche les traces de point de fusion pour une suite de protéines dans PBS. Les mesures robotisées ont été rassemblées avec un Nano ZS de Zetasizer, utilisant un rampe incrémental de la température 1°C et un temps mn de l'équilibre 3 à chaque température de mesure.

Le Schéma 3. traces de point de Fusion et valeurs du TM pour une suite de protéines dans PBS.

Le Système de Nano de Malvern Zetasizer

Le Nano ZS de Zetasizer des Instruments de Malvern est le premier instrument commercial pour comprendre le matériel et le logiciel pour des mesures dynamiques, statiques, et électrophorétiques combinées de dispersion de la lumière, donnant au chercheur un large éventail de propriétés témoin, y compris la taille, le poids moléculaire, et le potentiel de zéta. Le système a été particulièrement conçu pour répondre aux besoins faibles de volume de concentration et témoin en général associés avec des applications pharmaceutiques et biomoléculaires, avec les conditions de forte concentration pour des applications colloïdales. La Satisfaction de ce seul mélange des conditions faisait par l'intermédiaire de l'intégration d'un système optique rétrodiffusion et du design d'une cavité nouvelle de cellules. Par suite de ces caractéristiques techniques, les caractéristiques Nanoes de Zetasizer ZS pour la taille de l'échantillon et la concentration dépassent ceux pour n'importe quel autre instrument disponible dans le commerce de DLS, avec une classe de grandeur de 0.6nm à 6um, et un domaine de concentration du lysozyme 0.1mg/mL au poids/volume de 40%. Comme bonus ajouté, le matériel Nano de Zetasizer ZS est individu optimisant, et le logiciel comprend une seule mesure de « un claquement », analyse, et enregistre la caractéristique technique conçue pour réduire à un minimum la courbe d'apprentissage neuve d'utilisateur.

Date Added: May 9, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:22

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