Examen Critique de Cristallisation de Protéine À l'aide de la Dispersion de la Lumière Dynamique Utilisant le Matériel des Instruments de Malvern

Sujets Couverts

Mouvement Propre
     Accroissement des Cristaux de Protéine
     Le Deuxième Coefficient de Virial
     Mesure du Deuxième Coefficient de Virial
     Le Deuxième Coefficient de Virial et la Cristallogénèse Optimale
Détermination Associée de Problèmes Du Deuxième Coefficient de Virial
     Dispersion de la Lumière Dynamique
     Détermination Dynamique de Dispersion de la Lumière et de Dimension Particulaire
     Dispersion et Totalisation de la Lumière Dynamiques
Dispersion de la Lumière et Examen Critique Dynamiques de Cristallisation
Endo-pg I Examinant
     Dispersion de la Lumière Dynamique et Endo-pg I Examinant
Système de Nano de Zetasizer

Mouvement Propre

Au début des années 90, la dispersion de la lumière dynamique (DLS) a été introduite comme outil de dépistage pour la cristallographie. Au cours de la dernière décennie DLS est devenu largement reçu dans ce rôle, et des instruments dynamiques de dispersion de la lumière sont maintenant par habitude intégrés dans des laboratoires de cristallographie de Rayon X. Une fausse idée commune cependant, est que DLS peut indiquer à un quels échantillons sont susceptibles de fournir des cristaux. Dans la pratique, DLS plus convenablement est utilisé comme outil pour examiner à l'extérieur les échantillons qui sont peu susceptibles de fournir des cristaux. En cet article, nous adressons la différence subtile à ces remarques, et examinons la valeur des techniques de dispersion de la lumière en tant qu'outils de dépistage en cristal.

Accroissement des Cristaux de Protéine

Les tarifs déterminant la phase dans la définition des structures cristallines recensent les conditions optimas pour la cristallogénèse de haute qualité. Il y a une multitude de réactifs pour produire des « soupes » de quels cristaux de haute qualité sont développés. Cependant, toutes les recettes tendent à être détail de protéine, et tandis que la modification d'un mélange préféré pour adapter à un objectif neuf de protéine est l'élan normal, le plus souvent, la chance joue un rôle important dans le rétablissement des cristaux de protéine de haute qualité.

Le Deuxième Coefficient de Virial

Le deuxième coefficient virial (a)2 est une propriété thermo-dynamique décrivant la force d'interaction entre la protéine et le solvant. Pour des systèmes de protéine-solvant avec A2 > 0, la protéine « aime le solvant » davantage que lui-même et tend à être soluble. Quand A2 = 0, le solvant est décrit comme solvant de thêta, indiquant que la force d'interaction de particule-solvant est équivalente à la force d'interaction de particule-particule. Quand A2 << 0, la protéine « s'aime » beaucoup davantage que le solvant, et tend à totaliser dans le précipité amorphe. Quand A2 est juste légèrement négatif cependant, les conditions sont idéales pour la cristallogénèse de protéine à saturer des concentrations (le Schéma 1).

Le Schéma 1. taux de succès de cristallogénèse en fonction du 2ème coefficient virial (a)2.

Mesure du Deuxième Coefficient de Virial

Le 2ème coefficient virial est type mesuré utilisant des techniques statiques de dispersion (SLS) de la lumière. L'expression de Rayleigh employée pour décrire la dispersion de la lumière des particules plus petites que la longueur d'onde de la lumière d'incident est donnée dans l'Équation 1, où K est une constante optique, C est la concentration de particules, M est le poids moléculaire moyen de grammage, A2 est le 2ème coefficient virial, et Rè est le rapport de Rayleigh de disperser à l'intensité de lumière d'incident.

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Comme évident dans l'Équation 1, KC/Rè devrait être linéaire avec la concentration, avec une interception égale à 1/M et à une pente qui est proportionnelle à l'A.2

Le Deuxième Coefficient de Virial et la Cristallogénèse Optimale

L'utilisation du 2ème coefficient virial comme paramètre d'examen critique pour des états optimaux de cristallogénèse était suggèrent d'abord par Wilson et autres, qui a défini l'hublot de cristallisation en tant que -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10-4 (mole de ml/g)2. Ce slot d'hublot ou de cristal de cristallisation est mis en valeur comme zone II sur le Schéma 2, qui donne les résultats statiques de dispersion de la lumière pour le lysozyme à différentes concentrations en sel dans la solution tampon d'acide acétique (pH 4).

Le Schéma 2. traçages de Debye pour le lysozyme à différentes concentrations en NaCl dans la solution tampon d'acide acétique à pH 4. Mettre en valeur gris dans la zone II, définit le slot de cristallisation, où -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10.-4

Détermination Associée de Problèmes Du Deuxième Coefficient de Virial

Tandis Que les crystallographers ont apprécié la réussite utilisant l'hublot de cristallisation pour déterminer des conditions de solution optimale, le nombre de mesures, et par conséquent le temps nécessaire (vers le haut de 2 heures), évaluer A2 pour un solvant unique peut être problématique, en particulier pour ceux qui recherchent un élan élevé de débit à l'examen critique en cristal de protéine.

Dispersion de la Lumière Dynamique

DLS est une technique qui est complémentaire à la dispersion de la lumière statique, et peut être exécuté sur une échelle de temps mesurée en quelques minutes plutôt que des heures. Dans DLS, dispersant l'intensité des variations sont surveillées en travers des échelles de temps de µs et puis marquées. Les variations d'intensité sont une conséquence de mouvement de particules, et la propriété mesurée dans l'analyse de corrélation est la distribution des coefficients de diffusion. La taille est alors prévue utilisant l'équation de Charger-Einstein (Eq. 2), où la MAIN DROITE est le radius hydrodynamique, k est la constante de Boltzmann, T est la température, le ç est la viscosité dissolvante et D est le coefficient de diffusion.

(2)

Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 les zones sont ceux détaillées dans les traçages de Debye représentés sur le Schéma 2, et les distributions de grandeurs sont préposé du service de ceux mesurés chaque zone aux concentrations diluées utilisées pour des mesures statiques et dynamiques de dispersion de la lumière. Notez que %Pd = le ½ X 100 (d'Incrément de Multidispersion).

Dispersion de la Lumière et Examen Critique Dynamiques de Cristallisation

Suivant les indications du Schéma 4, DLS peut être employé pour examiner 2 sur les 3 conditions de solution il est peu susceptible mener qu'à la cristallogénèse de haute qualité, c.-à-d. échantillonne avec de grands impuretés et échantillons avec A <2 -8,0 x 10 moles-4 de ml/G. En général2 cependant, DLS ne peut pas discerner des échantillons dans la zone I, où la protéine est trop soluble pour produire des cristaux, de ceux dans la zone II (slot de cristallisation), où les conditions sont optimales pour le rétablissement en cristal de haute qualité. D'autre part, la cristallogénèse est par nature un procédé de totalisation, et en tant que, chercheurs sondent généralement la borne entre les zones II et III, plutôt que la borne entre les zones I et II. Ainsi alors que DLS peut ne pas être les chercheurs argentés de balle espérait qu'il serait, elle remplit toujours un rôle majeur dans sa capacité d'examiner à l'extérieur les échantillons qui sont peu susceptibles de produire les cristaux de haute qualité.

Endo-pg I Examinant

Un mécanisme commun pour l'interruption des cellules de centrale par des microbials pathogènes est la dégradation enzymatique de la pectine dans la paroi cellulaire par l'Endo-pg I, une hydrolase microbienne glycosylée. Dans les études récentes, Kato pouvaient et autres résoudre les structures cristallines de trois formes d'Endo-pg I du purpureum de Stereum - Endo-pg Ia, avec deux réseaux de sucre, Endo-pg IC, avec quatre réseaux de sucre, et De-Endo-pg Ia, la forme déglycosylée de l'Endo-pg Ia. Les chercheurs ne pouvaient pas cristalliser une quatrième forme de l'enzyme, Endo-pg Ib, avec trois réseaux de sucre selon la protéine, et difficulté enregistrée en obtenant des cristaux de qualité pour la forme de l'Endo-pg IC de l'enzyme.

Dispersion de la Lumière Dynamique et Endo-pg I Examinant

Le pré-cristal étudie pour la caractérisation comprise par projet de l'Endo-pg I DLS dans des conditions diluées. Les résultats de DLS pour l'étude sont affichés sur le Schéma 5, qui indique des valeurs de multidispersion de 7,4%, de 14,9%, et de 21,2% pour les trois formes de protéine où des cristaux ont été obtenus et 29,1% pour la forme qui n'a pas produit des cristaux. Ces résultats sont compatibles avec la règle empirique de Palladium de ~20% pour l'examen critique en cristal de DLS.

Le Schéma 5. résultats de DLS (Palladium = multidispersion) de la caractérisation de pré-cristal des quatre formes de l'Endo-pg I et des photos en cristal. obtenu et 29,1% pour la forme qui n'a pas produit des cristaux. Ces résultats sont compatibles avec la règle empirique de Palladium de ~20% pour l'examen critique en cristal de DLS.

Système de Nano de Zetasizer

Le système Nano de Zetasizer des Instruments de Malvern est le premier instrument commercial pour comprendre le matériel et le logiciel pour des mesures dynamiques, statiques, et électrophorétiques combinées de dispersion de la lumière. La large gamme de propriétés témoin disponibles pour la mesure avec le système Nano de Zetasizer comprennent, dimension particulaire, poids moléculaire, et potentiel de zéta.

Le système Nano de Zetasizer a été particulièrement conçu pour répondre aux besoins faibles de volume de concentration et témoin en général associés avec des applications pharmaceutiques et biomoléculaires, avec les conditions de forte concentration pour des applications colloïdales. La Satisfaction de ce seul mélange des conditions faisait par l'intermédiaire de l'intégration d'un système optique rétrodiffusion et du design d'une cavité nouvelle de cellules. Par suite de ces caractéristiques techniques, les caractéristiques Nanoes de Zetasizer pour la taille de l'échantillon et la concentration dépassent de loin ceux pour n'importe quel autre instrument dynamique disponible dans le commerce de dispersion de la lumière.

Le Schéma 6. système de Nano de Zetasizer d'Instruments de Malvern.

Note : Un ensemble complet de références peut être obtenu en se rapportant au document source.

Source : « Dispersion de la Lumière Dynamique - la Balle Argentée Pour l'Examen Critique En Cristal de Protéine ?  », Note d'Application par des Instruments de Malvern.

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît Malvern Instruments Ltd (R-U) ou les Instruments de Malvern (ETATS-UNIS).

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:22

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