Cristallizzazione della Proteina che Scherma Usando Scattering Leggero Dinamico Facendo Uso della Strumentazione dagli Strumenti di Malvern

Argomenti Coperti

Sfondo
     Crescita dei Cristalli della Proteina
     Il Secondo Coefficiente di Virial
     Misura del Secondo Coefficiente di Virial
     Il Secondo Coefficiente di Virial e la Crescita dei Cristalli Ottimale
Determinazione Associata di Problemi Del Secondo Coefficiente di Virial
     Scattering Leggero Dinamico
     Determinazione Leggera Dinamica di Dimensione delle Particelle e di Scattering
     Scattering ed Aggregazione Leggeri Dinamici
Selezione Leggera Dinamica di Cristallizzazione e di Scattering
Endo-pg I che Scherma
     Scattering ed Endo-pg Leggeri Dinamici I che Scherma
Sistema Nano di Zetasizer

Sfondo

Nell'inizio degli anni 90, lo scattering leggero dinamico (DLS) è stato presentato come strumento della selezione per la cristallografia. Negli ultimi dieci anni DLS è diventato ampiamente accettato in questo ruolo e gli strumenti leggeri dinamici di scattering ora sono integrati ordinariamente nei laboratori di Cristallografia a raggi x. Un'idea sbagliata comune tuttavia, è che DLS può dire uno quali campioni sono probabili rendere i cristalli. In pratica, DLS è usato più giustamente come strumento per la schermatura fuori dei campioni che sono improbabili da rendere i cristalli. In questo articolo, indirizziamo la differenza sottile in questi punti ed esaminiamo il valore delle tecniche leggere di scattering come strumenti di cristallo della selezione.

Crescita dei Cristalli della Proteina

La tariffa che determina il punto nella risoluzione dei sistemi cristallini sta identificando le condizioni ottimali per la crescita dei cristalli di alta qualità. C'è un gran numero di reagenti per la generazione “delle minestre„ da quali a cristallo di alta qualità si sviluppano. Tuttavia, tutte le ricette tendono ad essere proteina specifica e mentre modificare una miscela preferita per essere adatto ad un nuovo obiettivo della proteina è l'approccio standard, spesso, la fortuna svolge un ruolo significativo nella generazione di cristalli della proteina di alta qualità.

Il Secondo Coefficiente di Virial

Il secondo coefficiente virial (A2) è i beni termodinamici che descrivono la concentrazione di interazione fra la proteina ed il solvente. Per i sistemi del proteina-solvente con A2 > 0, la proteina “gradisce il solvente„ più di stesso e tende ad essere solubile. Quando A2 = 0, il solvente è descritto come solvente di teta, indicante che la concentrazione di interazione del particella-solvente è equivalente a concentrazione di interazione della particella-particella. Quando A2 << 0, la proteina “si gradisce„ molto più del solvente e tende a cumulare in precipitato amorfo. Quando A2 è appena leggermente quantità negativa tuttavia, le circostanze sono ideali per la crescita dei cristalli della proteina a saturare le concentrazioni (Figura 1).

Figura 1. indice di successo della Crescita dei cristalli in funzione del secondo coefficiente virial (A2).

Misura del Secondo Coefficiente di Virial

Il secondo coefficiente virial è misurato tipicamente facendo uso delle tecniche leggere statiche (SLS) di scattering. L'espressione di Rayleigh usata per descrivere lo scattering dell'indicatore luminoso dalle particelle più piccole della lunghezza d'onda della luce incidente si arrende l'Equazione 1, dove il K è una costante ottica, C è la concentrazione della particella, la M. è il peso molecolare di media del peso, A2 è il secondo coefficiente virial e Rè è il rapporto di Rayleigh del sparso di ad intensità della luce di luce incidente.

(1)

Come evidente nell'Equazione 1, KC/Rè dovrebbe essere lineare con concentrazione, con un'intercettazione uguale a 1/M e ad un pendio che è proporzionale al A.2

Il Secondo Coefficiente di Virial e la Crescita dei Cristalli Ottimale

L'uso del secondo coefficiente virial come parametro della selezione per gli stati ottimali della crescita dei cristalli era in primo luogo suggerisce da Wilson et al., che ha definito la finestra di cristallizzazione come -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10-4 (mol di ml/g)2. Questo slot della finestra o del cristallo di cristallizzazione è evidenziato come zona II nella Figura 2, che mostra i risultati leggeri statici di scattering per lisozima alle concentrazioni differenti nel sale in soluzione tampone dell'acido acetico (pH 4).

Figura 2. tracciati di Debye per lisozima alle concentrazioni differenti nel NaCl in soluzione tampone dell'acido acetico a pH 4. La messa in evidenza grigia nella zona II, definisce lo slot di cristallizzazione, in cui -0,8 x 10-4 > A2 > -8,0 x 10.-4

Determinazione Associata di Problemi Del Secondo Coefficiente di Virial

Mentre i cristallografi hanno goduto del successo facendo uso della finestra di cristallizzazione per stabilire i termini della soluzione ottimale, il numero delle misure e quindi il tempo richiesto (verso l'alto di 2 ore), valutare A2 per un singolo solvente può essere problematica, specialmente per quelle che cercano un alto approccio di capacità di lavorazione alla selezione di cristallo della proteina.

Scattering Leggero Dinamico

DLS è una tecnica che è complementare allo scattering leggero statico e può essere eseguito su una cronologia genealogica misurata nei minuti piuttosto che le ore. In DLS, spargente l'intensità le fluttuazioni sono riflesse attraverso le cronologie genealogiche dei µs e poi sono correlate. Le fluttuazioni dell'intensità sono una conseguenza di moto della particella ed i beni misurati nell'analisi di correlazione sono la distribuzione dei coefficienti di diffusione. La dimensione poi è calcolata facendo uso dell'equazione di Rifornire-Einstein (Eq. 2), dove il RH è il raggio idrodinamico, K è la costante di Boltzmann, T è la temperatura, il ç è la viscosità solvente e la D è il coefficiente di diffusione.

(2)

Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 le zone sono quelle dettagliate nei diagrammi di Debye come appare Figura 2 e le distribuzioni per ampiezza sono rappresentante di quelle misurate per ogni zona alle concentrazioni diluite usate per le misure leggere statiche e dinamiche di scattering. Si Noti che %Pd = (½ x 100 di Indice Analitico di Multidispersione).

Selezione Leggera Dinamica di Cristallizzazione e di Scattering

Secondo le indicazioni di Figura 4, DLS può essere usato per schermare 2 sui 3 stati della soluzione che sono improbabili da piombo alla crescita dei cristalli di alta qualità, cioè campiona con le grandi impurità e campioni con A <2 -8,0 x 10 mol-4 di ml/G. In Generale2 comunque, DLS non può distinguere i campioni nella zona I, dove la proteina è troppo solubile per produrre i cristalli, da quelli all'interno della zona II (slot di cristallizzazione), dove le circostanze sono ottimali per la generazione del cristallo di alta qualità. D'altra parte, la crescita dei cristalli è inerentemente un trattamento dell'aggregazione e come tale, i ricercatori stanno sondando generalmente il limite fra le zone II ed III, piuttosto che il limite fra le zone I ed II. Così mentre DLS non può essere i ricercatori d'argento del richiamo stava sperando che sia stato, ancora compie un ruolo importante nella sua capacità di schermare fuori i campioni che sono improbabili da produrre i cristalli di alta qualità.

Endo-pg I che Scherma

Un meccanismo comune per la rottura delle cellule vegetali dai microbials patogeni è la degradazione enzimatica di pectina nella parete cellulare dall'Endo-pg I, un'idrolasi microbica glicosilata. Negli studi recenti, Kato et al. poteva risolvere i sistemi cristallini di tre moduli dell'Endo-pg I dal purpureum di Stereum - l'Endo-pg Ia, con due catene dello zucchero, Endo-pg CI, con quattro catene dello zucchero e l'De-Endo-pg Ia, il modulo deglicosilato dell'Endo-pg Ia. I ricercatori non potevano cristallizzare un quarto modulo dell'enzima, l'Endo-pg Ib, con tre catene dello zucchero per proteina e la difficoltà riferita nell'ottenere i cristalli di qualità per il modulo dell'Endo-pg CI dell'enzima.

Scattering ed Endo-pg Leggeri Dinamici I che Scherma

Il pre-cristallo studia per la caratterizzazione inclusa il progetto dell'Endo-pg I DLS nelle circostanze diluite. I risultati di DLS per lo studio sono indicati nella Figura 5, che indica i valori della multidispersione di 7,4%, di 14,9% e di 21,2% per i tre moduli della proteina in cui gli a cristallo sono stati ottenuti e 29,1% per il modulo che non è riuscito a produrre i cristalli. Questi risultati sono coerenti con la regola empirica del Palladio di ~20% per la selezione di cristallo di DLS.

Figura 5. risultati di DLS (Palladio = multidispersione) dalla caratterizzazione del pre-cristallo dei quattro moduli dell'Endo-pg I e delle foto di cristallo. verificato e 29,1% per il modulo che non è riuscito a produrre i cristalli. Questi risultati sono coerenti con la regola empirica del Palladio di ~20% per la selezione di cristallo di DLS.

Sistema Nano di Zetasizer

Il sistema Nano di Zetasizer dagli Strumenti di Malvern è il primo strumento commerciale per comprendere il hardware ed il software per le misure leggere dinamiche, statiche ed elettroforetiche combinate di scattering. La vasta gamma dei beni del campione disponibili per la misura con il sistema Nano di Zetasizer include, dimensione delle particelle, peso molecolare e potenziale Zeta.

Il sistema Nano di Zetasizer specificamente è stato destinato per soddisfare le richieste basse del volume di campione e di concentrazione connesse tipicamente con le applicazioni farmaceutiche e biomolecolari, con i requisiti di alta concentrazione delle applicazioni colloidali. La Soddisfazione della questa miscela unica dei requisiti faceva via l'integrazione di un sistema ottico di backscatter e della progettazione di una camera novella delle cellule. In conseguenza di queste funzionalità, le specifiche Nane di Zetasizer per la dimensione del campione e la concentrazione lontano superano quelle per qualunque altro strumento leggero dinamico disponibile nel commercio di scattering.

Figura 6. sistema Nano di Zetasizer degli Strumenti di Malvern.

Nota: Un insieme completo dei riferimenti può essere ottenuto riferendosi al documento di origine.

Sorgente: “Scattering Leggero Dinamico - il Richiamo D'argento Per la Selezione Di Cristallo della Proteina? „, Nota di Applicazione dagli Strumenti di Malvern.

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego Strumenti la Srl (REGNO UNITO) di Malvern o gli Strumenti di Malvern (U.S.A.).

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:28

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit