Malvern の器械からの装置を使用してダイナミックな光散乱の使用によって選別する蛋白質の結晶化

カバーされるトピック

背景
     蛋白質の水晶の成長
     Virial 第 2 係数
     Virial 第 2 係数の測定
     Virial 第 2 係数および最適の結晶成長
Virial 第 2 係数の問題の準の決定
     ダイナミックな光散乱
     ダイナミックな光散乱および粒度の決定
     ダイナミックな光散乱および集合
ダイナミックな光散乱および結晶化のスクリーニング
選別する EndoPG I
     選別するダイナミックな光散乱および EndoPG I
Zetasizer の Nano システム

背景

1990年代初期に、ダイナミックな光散乱は (DLS)結晶学のためのスクリーニングのツールとしてもたらされました。 ここ十年間 DLS はこの役割で広く受け入れられるようになり、ダイナミックな光散乱の器械は X 線の結晶学の実験室に今定期的に統合されます。 しかしよくある誤解は、水晶をもたらすためにどのサンプルが本当らしいか DLS が 1 告げることができることです。 実際には、 DLS は水晶をもたらしてまずないサンプルを選別するためのツールとしてより適切に使用されます。 この記事では、私達はこれらのポイントの微妙な相違をアドレス指定し、水晶スクリーニングのツールとして光散乱の技術の値を検査します。

蛋白質の水晶の成長

結晶構造の解像度のステップを定めるレートは良質の結晶成長のための最適条件を識別しています。 どの良質の水晶が生成する育つかための多数の試薬がからの 「スープ」をあります。 ただし、すべての調理法は蛋白質の細目でありがちで好みの組合せを新しい蛋白質ターゲットに適するために修正することが標準アプローチの、少なからず間、運は良質蛋白質の水晶の生成の重要な役割を担います。

Virial 第 2 係数

第 2 virial 係数 (a) は2蛋白質と溶媒間の相互作用の強さを記述する熱力学的性質です。 蛋白質溶媒システムのためにとの A は2 > 0、蛋白質 「溶媒」もっとより自体を好み、溶けがちです。 A が2 Θの溶媒として = 0、溶媒記述されている時、粒子溶媒相互作用の強さが粒子粒子の相互作用の強さと同等であることを示す。 A が <<2 0、蛋白質 「それ自身を」大いにもっとより好むとき溶媒は、無定形の沈殿物に集約しがちで。 しかし A が2 ちょうどわずかに否定的なとき、条件は集中 (図 1) の飽和で蛋白質の結晶成長にとって理想的です。

第 2 virial 係数 (a) の機能として図 1. 結晶成長の成功率2

Virial 第 2 係数の測定

第 2 virial 係数は静的な光散乱の技術を使用して普通 (SLS)測定されます。 K が光学定数であるところで入射光の波長より小さい粒子からのライトの分散を記述するのに使用される Rayleigh の表現が同等化 1 で、 C です粒子の集中与えられます、 M は量平均分子量です、 A は2 第 2 virial 係数であり、 Rè は入射光の強度への分散させるの Rayleigh の比率です。

(1)

同等化 1 で明白ように、 KC/Rè は 1/M および A. に比例している斜面と等しい妨害との集中と線形、べきです。2

Virial 第 2 係数および最適の結晶成長

最適の結晶成長の状態のためのスクリーニングパラメータとして第 2 virial 係数の使用は -0.8 x 10 と結晶化の Windows を > A > -8.0 x 10 定義したウイルソン-4 によって最初に2 等提案しますありました、-4 (mL mol の/g)2。 この結晶化の Windows または水晶スロットは酢酸バッファ (pH 4) で異なった塩の集中でリゾチームのための静的な光散乱の結果を示す図 2 のゾーン II として強調されます。

pH 4. の酢酸バッファの異なった NaCl の集中のリゾチームのための図 2. Debye のプロット。 ゾーン II の灰色の強調が、結晶化スロットを、 -0.8 x 10 >-4 A >2 -8.0 x 10. 定義する。-4

Virial 第 2 係数の問題の準の決定

測定の最適解の条件、番号、およびそれ故に 2 時間の (上向きに) 必要な時間を確立するために crystallographers が結晶化の Windows を使用して成功を楽しむ間、単一の2 溶媒のための A を評価することは高いスループットアプローチを追求するそれらのために問題となります、蛋白質の水晶スクリーニングに特に。

ダイナミックな光散乱

DLS は静的な光散乱に補足ので、時間目盛で分に測定される時間よりもむしろ行うことができます技術。 強度を分散させる DLS では変動は µs の時間目盛を渡って監視され、次に関連します。 強度の変動は粒子の動きの結果であり、相関解析の測定された特性は拡散係数の分布です。 サイズはかき立て Einstein の同等化 (Eq を使用してそれから計算されます。 2) は、 RH が流体力学の半径であるところに、 k ボルツマン定数です、 T は温度です、 ç は支払能力がある粘着性であり、 D は拡散係数です。

(2)

Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 ゾーンは図 2 で示されている Debye のプロットで詳しく述べられるそれらでありサイズ分布は静的で、ダイナミックな光散乱の測定に使用する希薄な集中で各ゾーンのために測定されるそれらの代表です。 ことに %Pd = (Polydispersity 指標) ½ X 100 注目して下さい。

ダイナミックな光散乱および結晶化のスクリーニング

図 4 に示すように良質の結晶成長に導いてがまずない 3 つの解決の状態から 2 つを選別するのに、大きい不純物そしてサンプルと DLS がすなわち見本抽出しますとの A < mL -8.02 x 10 の mol の/-4 G. 使用することができます。 しかし2大将では、 DLS はゾーン II (結晶化スロット) の内のそれらと条件が良質の水晶生成のために最適であるところで蛋白質が水晶を作り出すには余りにも溶けるかところでゾーン I のサンプルを区別できません。 一方では、結晶成長はゾーンの間で境界よりもむしろゾーンの間で本来そしてそれ自体集合プロセス研究者一般に厳密に調べています境界を II および III、 I および II. です。 従って DLS は望んでいた銀製の弾丸の研究者ではないかもしれないがあることを、それはまだ良質の水晶を作り出してまずないサンプルを選別する機能に於いての重要な役割を達成します。

選別する EndoPG I

病原性のある microbials によるプラントセルの中断のための共通のメカニズムは EndoPG I の glycosylated 微生物加水分解酵素によって細胞壁のペクチンの酵素の劣化行います。 最近の調査では、 Kato は等 Stereum の purpureum - EndoPG Ia からの EndoPG I の 3 つの形式の結晶構造を、 4 つの 砂糖の および非 EndoPG Ia の EndoPG Ia の非 glycosylated 形式との 2 つの砂糖の鎖 EndoPG IC が付いている、解決 できました。 研究者は酵素、蛋白質ごとの 3 つの砂糖の鎖、および酵素の EndoPG IC 形式のための品質の水晶の取得の報告された難しさの EndoPG Ib の第 4 形式を、結晶させてなかったです。

選別するダイナミックな光散乱および EndoPG I

前水晶は希薄な条件の下で EndoPG I プロジェクトによって含まれている DLS の性格描写のために調査します。 調査のための DLS の結果は水晶がおよび水晶を作り出さなかった形式のための 29.1% 得られた 3 つの蛋白質形式のための 7.4%、 14.9%、および 21.2% という polydispersity の値を明記する図 5 で示されています。 これらの結果は DLS の水晶スクリーニングのための ~20% Pd の経験則に一貫しています。

EndoPG I および水晶写真の 4 つの形式の前水晶の性格描写からの図 5. DLS の結果 (Pd = polydispersity)。 得られるおよび水晶を作り出さなかった形式のための 29.1%。 これらの結果は DLS の水晶スクリーニングのための ~20% Pd の経験則に一貫しています。

Zetasizer の Nano システム

Malvern の器械からの Zetasizer Nano システムは結合されたダイナミックで、静的な、電気泳動の光散乱の測定のためのハードウェアそしてソフトウェアを含む最初の商業器械です。 Zetasizer Nano システムとの測定のために使用できるサンプル特性の広い範囲は、粒度、分子量およびゼータの潜在性含んでいます。

Zetasizer Nano システムはとりわけ普通コロイドアプリケーションのための高い濃度の条件と共に薬剤および biomolecular アプリケーションと、関連付けられた低い集中およびサンプルボリューム条件を満たすように設計されていました。 条件のこの一義的な組合せを満たすことは新しいセル区域の後方散乱の光学系そしてデザインの統合によって堪能でした。 これらの機能の結果として、サンプルの大きさのための Zetasizer の Nano 指定および集中はずっと他のどの商用化されたダイナミックな光散乱の器械のためのもそれらを超過します。

図 6. Malvern の器械の Zetasizer の Nano システム。

注: 参照の完全セットは原書類を示すことによって得ることができます。

ソース: 「ダイナミックな光散乱 - 蛋白質の水晶スクリーニングのための銀製の弾丸か。」、 Malvern の器械によるアプリケーションノート。

このソースのより多くの情報のために Malvern の器械株式会社 (イギリス) または Malvern の器械 (米国) を訪問して下さい。

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:30

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