蛋白質通過使用動態光散射的結晶審查使用從 Malvern 儀器的設備

包括的事宜

背景
     蛋白質水晶增長
     第二個 Virial 系數
     第二個 Virial 系數的評定
     第二個 Virial 系數和最佳的晶體成長
第二個 Virial 系數的問題關聯確定
     動態光散射
     動態光散射和顆粒大小確定
     動態光散射和彙總
動態光散射和結晶審查
內前列腺素我審查
     動態光散射和內前列腺素我審查
Zetasizer 納諾系統

背景

在 20 世紀 90 年代初,動態光散射 (DLS)被引入作為為結晶學的一個審查工具。 在過去十年中 DLS 在此角色變得廣泛接受,并且動態光散射儀器定期地現在集成 X-射線結晶學實驗室。 然而一種常見的誤解,是 DLS 可能告訴一个哪些範例可能產生水晶。 實際上, DLS 更加適當地使用作為為篩選出是不太可能產生水晶的範例的一個工具。 在此條款上,我們解決在這些點上的細微的區別,并且檢查光散射技術的值作為水晶審查工具。

蛋白質水晶增長

確定在晶體結構的解決方法的這種費率步驟識別優質晶體成長的最佳條件。 有一許多生成的 「湯」試劑從哪些優質水晶增長。 然而,所有處方傾向於是蛋白質特定,并且,當修改偏愛的混合配合一個新的蛋白質目標是標準途徑,多半時,運氣在優質蛋白質水晶的生成扮演重大的作用。

第二個 Virial 系數

第二個 virial 系數 (a)2 是描述在蛋白質和這種溶劑之間的一種熱力學性質交往力量。 对蛋白質溶劑系統與 A2 > 0,蛋白質 「喜歡這種溶劑」更比本身并且傾向於是可溶解的。 當 A2 = 0,溶劑被描述作為希臘字母的第八字溶劑,表明微粒溶劑交往力量與微粒微粒交往力量是等同的。 當 A2 << 0,蛋白質 「喜歡自己」更比時這種溶劑,和傾向於綜合到無定形的沉澱物。 然而時當2 A 是輕微負的,條件對蛋白質晶體成長是理想的在飽和濃度 (圖 1)。

圖 1. 晶體成長作為第 2 個 virial 系數 (a) 功能的成功率2

第二個 Virial 系數的評定

使用靜態光散射技術,第 2 個 virial 系數典型地 (SLS)被評定。 用於的 Rayleigh 表達式描述分散從微粒的光小於入射光的波長在式 1 產生,其中 K 是一個光學常數, C 是微粒濃度, M 是重均分子量, A2 是第 2 個 virial 系數,并且 Rè 是 Rayleigh 比分散與入射光強度。

(1)

如明顯在式 1, KC/Rè 應該是線性的與濃度,與截住等於與 1/M 和與 A. 是按比例的傾斜。2

第二個 Virial 系數和最佳的晶體成長

使用第 2 個 virial 系數作為最佳的晶體成長情況的一個審查參數是由威爾遜等首先建議,定義結晶視窗成 -0.8 x 10-4 > A2 > -8.0 x 10-4 (mol mL/g)2。 此結晶視窗或水晶槽在表 2 被顯示作為區域 II,顯示溶菌酶的靜態光散射結果以不同的鹽含量在乙酸緩衝 (酸碱度 4)。

圖 2. 溶菌酶的 Debye 劇情以在乙酸緩衝的不同的 NaCl 含量在酸碱度 4。 灰色顯示在區域 II,定義了結晶槽, -0.8 x 10-4 > A2 > -8.0 x 10。-4

第二個 Virial 系數的問題關聯確定

當 crystallographers 享受成功使用結晶視窗設立最佳方案條件、評定的數量,並且需時 (向上 2 時數) 時,評估2 一種唯一溶劑的 A 可以是有問題的,特別地為尋找一個高處理量途徑的那些對蛋白質水晶審查。

動態光散射

DLS 是補充的對靜態光散射的技術,并且可以執行在時間表被評定在分鐘而不是幾小時。 在 DLS,分散強度波動在 µs 時間表間被監控然後關聯。 強度波動是微粒行動的結果,并且在相關分析的被評定的屬性是擴散率的配電器。 使用昇火愛因斯坦等式 (Eq,這個範圍然後被計算。 2),其中 RH 是這條水力半徑, k 是伯磁曼常數, T 是這個溫度, ç 是溶解的黏度,并且 D 是擴散率。

(2)

Dynamic Light Scattering and Particle Size Determination

Figure 3 shows a representative particle size distribution determined using DLS. Since the scattering intensity is ~ proportional to the particle molecular weight, DLS is very sensitive to aggregation and large impurities, even at low concentrations.

Figure 3. Representative DLS intensity particle size distribution.

As such, the technique is ideally suited for distinguishing samples that are unlikely to yield high quality crystals, due to the presence of impurities or non-specific aggregates, i.e. solutions residing in zone III of a Debye plot (Figure 2) where A2 << 0.

Dynamic Light Scattering and Aggregation

Figure 4 shows a comparison of the types of aggregation observed at both high and low concentration for typical protein samples, along with typical size distributions measured using DLS. The rule of thumb target for crystal screening using DLS is ~20% polydispersity (Pd), i.e. if the Pd < ~20% the sample is considered to be an ideal single population with no aggregates present. If the Pd > 20% on the other hand, the presence of non-specific aggregates, various oligiomeric states, and/or impurities decreases the likelihood of high quality crystal generation.

Figure 4. Schematic showing the types of aggregation observed at low and high concentration for typical protein samples. The A2 區域是在 Debye 劇情詳述的那些顯示在圖 2 上,并且大小分佈是為每個區域評定的那些的代表以用於靜態和動態光散射評定的稀釋濃度。 注意 %Pd = (多分散性索引) ½ x 100。

動態光散射和結晶審查

如圖 4 所顯示, DLS 可以用於篩選 2 出於是不太可能導致優質晶體成長的 3 個解決方法條件,即抽樣與大雜質和範例與 A <2 -8.0 x 10 mol-4 mL/G。 一般2雖則, DLS 不可能與那些區分範例在區域我,其中蛋白質太可溶解的以至於不能生產水晶,在區域 II (結晶槽) 內,其中條件為優質水晶生成是最佳的。 另一方面,晶體成長固有地是彙總進程,以及同樣,研究員一般探查這個限定範圍在區域之間 II 和 III,而不是這個限定範圍在區域之間我和 II。 因此,而 DLS 可能不是銀色項目符號研究員希望它是,它仍然執行在其能力的重要作用篩選出是不太可能生產優質水晶的範例。

內前列腺素我審查

工廠細胞的中斷的一個公用結構由致病性 microbials 的是果膠的酶降低在細胞壁的由內前列腺素我,葡基化的微生物水解酶。 在最近研究中, Kato 等能解決內前列腺素的三份表單晶體結構我從 Stereum purpureum - 二條糖鏈子,內前列腺素集成電路的內前列腺素 Ia,與四個糖鏈子和 非內前列腺素 Ia,內前列腺素 Ia 的非葡基化的 表單 研究員無法明確酵素,與三個糖鏈子每蛋白質和報告的困難的內前列腺素 Ib 的第四份表單,在獲得酵素的內前列腺素集成電路表單的質量水晶。

動態光散射和內前列腺素我審查

前水晶為我在稀釋情況下設想包括的 DLS 描述特性的內前列腺素學習。 這個研究的 DLS 結果在表 5 顯示,指示多分散性值為 7.4%, 14.9% 和 21.2% 三份蛋白質表單的水晶獲得和 29.1% 表單的沒有能生產水晶。 這些結果與 DLS 水晶審查的 ~20% Pd 概測法是一致的。

圖 5. DLS 結果 (Pd = 多分散性) 從內前列腺素的四份表單的前水晶描述特性我和水晶照片。 獲得和 29.1% 沒有能生產水晶的表單的。 這些結果與 DLS 水晶審查的 ~20% Pd 概測法是一致的。

Zetasizer 納諾系統

從 Malvern 儀器的 Zetasizer 納諾系統是包括硬件和軟件的第一個商業契約聯合的動態,靜態和電泳光散射評定的。 大範圍範例屬性可用為與 Zetasizer 納諾系統的評定包括,顆粒大小、分子量和 Zeta 潛在。

Zetasizer 納諾系統特別地被設計符合低濃度和範例數量要求典型地與配藥和生物化子的應用相關,以及膠質應用的高濃度需求。 滿足需求的此唯一混合通過一個背景散射的光學系統和一個新穎的細胞房間的設計的綜合化是實現的。 作為這些功能結果,樣本大小的 Zetasizer 納諾說明和濃度超出那些其他商業可用的動態光散射儀器的。

圖 6. Malvern 儀器 Zetasizer 納諾系統。

注意: 參考一個完整集可以通過是指源文檔獲得。

來源: 「動態光散射 - 蛋白質水晶審查的銀色項目符號?」,由 Malvern 儀器的應用註解。

關於此來源的更多信息请請參觀 Malvern 有限公司 (英國) 儀器Malvern 儀器 (美國)

Date Added: May 13, 2005 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 01:16

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