Anpassung Aktivitäts-Verhältnisse: Warum Verformen sich Moleküle?

Dr. Gerry Ronan, CEO, Farfield Group Ltd.
Entsprechender Autor: gronan@farfield-group.com

Hintergrund

Biochemie wird durch schwaches gekennzeichnet, nicht kovalent, Anleihen zwischen großen Biopolymeren, die kontinuierlich an unterschiedlichen Reaktionsstärken gemacht und gebrochen sind. Die Interaktionskräfte, verkörpert nach Baumuster Kräfte van Der Waals können durch den Interaktionsabstand zur Leistung von 6 schwanken und deshalb „befestigte“ die Fähigkeit von einem Molekül zu oder passt an die Form einer Falte an, oder Tasche auf anderen treibt die Reaktion.

Andererseits kann ein verbindlicher Partner die Anpassung eines Biomoleküls (z.B. ein Protein) verzerren um eine mögliche biochemische Aktivität zu aktivieren oder zu deaktivieren, welche dadurch die Reaktion regelt. Tatsächlich ist dieses die grundlegende Voraussetzung hinter pharmazeutischer Intervention, in der kleine Moleküle bestimmt sind, damit ihre Fähigkeit selektiv die Anpassung eines Zielproteins zusammenwirkt und verzerrt, das in einer Krankheitsvorrichtung impliziert wird.

Doppel-Polarisation Interferometrie (DPI) misst die Anpassung eines Proteins, indem sie seinen Durchmesser (oder Größe) und die Dichte (d.h., seine Massenkonzentration oder, wie fest gefaltet ihm ist), indem die Kopplung des Proteins zu einem Objektträger und das Prüfen unter Verwendung der nicht-beugenden Optik misst. Die Methode löst Proteinanpassung zu den subatomaren Abmessungen (gut unter 0,1 Å) in der Istzeit und hat eine wachsende Abnahme unter Forschern auf dem Gebiet der Proteinkennzeichnung, eine wesentliche Disziplin in der Wissenschaft von proteomics.

In Farfield hat unsere Arbeit in den letzten zehn Jahren um das direkte Maß der Form oder Anpassung von Biomolekülen rotiert und wie diese ändert, während die Biomoleküle arbeiten. Diese Fähigkeit, das Anpassungs-Aktivitäts-Verhältnis zu überwachen (CAR) wird in einem benchtop analytischen Hilfsmittel verkündet, das als ein DoppelPolarisations-Interferometer bekannt ist,1 das die molekulare Größe und die Faltendichte (und häufen Sie deshalb) an von den zusammenwirkenden Biomolekülen misst, die auf einem Objektträger erfasst werden. Die Technik hat Picometerauflösung, ist Echtzeit und beschriftet frei und hat bereits ein wachsendes userbase über 19 weltweiten Ländern.

Die Bedeutung von Anpassungs-Aktivitäts-Verhältnissen (CAR)

Zum Beispiel in der pharmazeutischen Auslegung, wählt ein herkömmlicher Drogenscreeningprogrammwille Kandidaten von einer Bibliothek von vielen tausend wenn nicht Millionen auf der Grundlage von ihre Fähigkeit, an dem Proteinziel selektiv festzuhalten (wie in der Krankheitsvorrichtung impliziert) aus, gekennzeichnet als die Affinität der Interaktion. Eine hohe Affinitätsinteraktion kann bei sehr niedrigen Konzentrationen des Kandidaten auftreten und deshalb ist der Kandidat weniger wahrscheinlich, Nebenwirkungen anderswo zu verursachen. Jedoch gibt hohe Affinität keine Versicherung, dass der Kandidat das Biomolekül richtig oder überhaupt anpaßt. Würde nicht es besser sein, ein unteres Affinitätsmolekül zu haben und verursachen würde die korrekte Anpassung für die gewünschte Aktivität, die dann optimiert werden könnte (durch molekulare Technik) um seine Affinität zu erhöhen?

Ein einfaches Beispiel wird gezeigt, unten wo ein Zielprotein (Prionsprotein, wie im nvCJD impliziert) durch verschiedene Konzentrationen einiger Metallionen angefochten wird. Von der Masse des Metallions dazugehört bei jeder Konzentration können die Affinität (und die Stöchiometrie) gemessen werden. Gleichwohl von den Größen- und Dichteprofilen man sofort sehen kann, dass Kobalt nicht das Molekül verzerrt, während Zink, das eine ähnliche Affinität hat, tut.

Außerdem hebt die angleichbare Änderung, die im Falle des Kupfers offensichtlich ist (eine Komprimierung gezeigt als Abnahme an der Größe des Proteins und Zunahme seiner Dichte) nicht völlig auf (d.h. sie hat in eine andere stabile Anpassung oder in ein isoform leicht geschlagen), während die angleichbare Änderung mit Zink völlig aufhebt. Drei verschiedene Anpassungs-Aktivitäts-Verhältnisse von drei Interaktionen mit ähnlicher Affinität.

Abbildung 1. Beispiele von verschiedenen Anpassungs-Aktivitäts-Verhältnissen für verbindliche Interaktionen der ähnlichen Affinität von den Metallionen, die zum Prionsprotein (PrP) binden. Gezeigt die Masse der Vereinigung und der Auflösung der verschiedenen Metallionen bei verschiedenen Konzentrationen (von, welchen die Interaktionsaffinität berechnet werden kann) und die entsprechenden Größen- und Dichteprofile (von, welchem die angleichbaren Änderungen gemessen werden können). Die maximale angleichbare Änderung (Cu) ist 0.04nm und jede Herausforderung war eine winzige Einspritzung 5. (Datenhöflichkeit von Gifu Univ, von Japan)

Angleichbare Änderungen in den Dünnfilmen

Weicher Stoff (z.B. Polymere) ist auch abhängig von ähnlichen Verzerrungen und häufig es ist diese formbare Natur, die das bestimmende Merkmal am nanoscale ist. DoppelPolarisations-Interferometrie (DPI) ist auch zur Charakterisierung dieser Änderungen in den Polymeren fähig und misst die Dicke und Brechungskoeffizient und Vereinbarung mit anderen analytischen Techniken wie Neutronreflexion und ellipsometry ist2 wie gezeigt unten in Abbildung 2. ausgezeichnet. Anders Als ellipsometry jedoch bestimmt DPI die Stärke und RI unabhängig einander willkürlich an den Dünnschichten und anders als Neutrondaten, tut es dies in der Istzeit in einem benchtop Format mit den experimentellen und Steuerkanälen.

Abbildung 2. Vergleich von DPI und ellipsometery Maße eines mehrschichtigen Konstruktes des Polyelektrolyts. An der starken Schichtvereinbarung für Stärke (d) und Brechungskoeffizienten ist (N) ausgezeichnet. An den verringerten ellipsometry Stärken benötigt die Kenntnisse des RI (oder der Stärke) um die Stärke (oder RI) zu berechnen während DPI die Dünnschichten willkürlich messen kann, welche die Schwankung in die Dichte aufdecken, die mit abwechselndem positivem und negativ verbunden ist - belastetes Schichtabgeben. (Datenhöflichkeit von YKI, Stockholm)

Viele anderen Beispiele solcher Selbst zusammengebauten Konstrukte sind studierte zum Beispiel DNS-multilayers,3-chitosan/-heparin4und -polyelektrolyte gewesen5,6.

Selbstverständlich gibt es viele Baumuster angleichbare Reorganisation von Zinsen, die kein verbindliches Ereignis miteinbeziehen. Das Polymerschwellen passend zum Ändern von pH ist ein solcher Prozess, der kann an einer Auflösung schnell und leicht wieder gekennzeichnet werden normalerweise verbunden mit „großer Physik“. Ein einfaches Beispiel wird in Abbildung 3 gezeigt, wo ein Oberfläche erfasster Dünnfilm von Poly (allylamine) über einer Reichweite der pHs studiert wird. Mit niedrigem pH veranlaßt das protonation des Polymers die Schicht zu schwellen während an mit hohem pH-Wert die Schichtverträge und die Dichtezunahmen.

Abbildung 3. Polymerschwellen wegen des protonation, wie durch DoppelPolarisations-Interferometrie gemessen

Diese Maße können auf Biopolymere auch ausgedehnt werden, in denen Übergänge von einem isoform zu einem anderen und auch isoform Stabilität in einer Grundmasse von verschiedenen Temperaturen, von pHs, von Ionenstärken, von Lösungsmitteln oder von anderen Umwelt- oder refolding Bedingungen gekennzeichnet werden können.

Die Zukunft der DoppelPolarisations-Interferometrie

Seit seiner Einleitung im Jahre 20037, ist DoppelPolarisations-Interferometrie bei einer großen Auswahl von Forschern auf der ganzen Welt in der Lebensdauer und in den körperlichen Wissenschaften angenommen worden. Seine Fähigkeit, molekulare Anpassung an der Voratomauflösung zu messen und zu kennzeichnen hat grundlegend neue Gelegenheiten für Nano-- und Biowissenschaftsforschung erstellt. Die späteste Generation der Instrumentierung, der Bioarbeitsplatz 4D ist zu einer erweiterten Temperatur zu 65°C fähig, das das Maß der Proteinschmelze und anderer molekularer Phasenübergänge erlaubt.

Indem man die Kinetik und die Affinität von Interaktionen bei den verschiedenen Temperaturen kennzeichnet, ist es auch möglich, die freie Energie, die Enthalpie und die Entropie nicht nur von binden aber auch von angleichbaren Änderungen mengenmäßig zu bestimmen8. Dieses erlaubt zum ersten Mal das direkte Maß der Affinität, der Kinetik, der Thermodynamik und der angleichbaren Änderung des Bindens oder einfach refolding in einem einzelnen Experiment.

Abbildung 4. Ein DoppelPolarisations-Interferometer benchtop Instrument mit automatisierter Beispieleinleitung.

In der Zukunft werden höherer Durchsatz und kleinere Probenmengen für das Mit filter versehen von Anwendungen gefordert, aber es gibt viele anderen Niveaus von spektralanalytischen Informationen, die extracted.from auch sein können der Bioarbeitsplatz 4D. Maß von sehr Anfangsstadiumprotein-Kristallkernbildung ist9 bereits unter Verwendung des optischen Verlustes demonstriert worden, während Doppelbrechung jetzt verwendet wird, um Ordnung und Störung in Lipid bilayers zu messen, um10 Proteinlipidinteraktionen zu kennzeichnen. 11Unsere Vision für das folgende Jahrzehnt ist, die Treue der Kennzeichnung in diesen Abmessungen auch zu erhöhen, um die molekulare Welt wirklich zu leuchten!


Bezüge

1. Swann M.J., Freeman N.J, Quer-Interferometrie G. Dual Polarization: Eine Optische Echtzeittechnik für das Messen (der Bio) Molekularen Orientierung, der Zelle und der Funktion an der Festen/Flüssigen Schnittstelle. In: Handbuch von Biosensors und von Biochips, Set des Volumen-2 (2007). Eds: R.S. Marks, C.R. Lowe, D.C. Cullen, H.H. Weetall, I. Karube. Wiley, ISBN: 978-0-470-01905-4, Vol1, Teil 4, ch33, pp549-568.
2. Halthur T., Claessen P., Elofsson U., Immobilisierung des Decklack-Grundmasse-Derivat-Proteins auf Polypeptid Multilayers, Vergleichbare in-situMaße Unter Verwendung Ellipsometry, Schwingquarz-Mikrowaage mit Ableitung und Doppel-Polarisation Interferometrie. Langmuir (2006) 22(26) 11065-71.
3. Lee L., Johnston A.P., Caruso F., das Salz und die Wärmebeständigkeit von mehrschichtigen Filmen DNS über Oligonucleotidelänge Manipulierend. Biomacromolecules (2008) November 9(11): 3070-8. Epub 2008 Am 1. Oktober.
4. Lundin M., Blomberg E., Tilton R.D., Polymer-Dynamik in Schicht-durch-Schicht Montagen des Chitosans und Heparin, Langmuir, Artikel SO BALD WIE MÖGLICH, Veröffentlichungs-Dattel (Selennetz): Am 18. November (2009) (Artikel) DOI: 10.1021/la902968h.
5. Aulin C., Varga I., Claesson P.M., Wågberg L., Lindström T., Ansammlung von Polyelektrolyt multilayers von polyethyleneimine und microfibrillated Zellulose studiert durch in-situ-Doppel-polarisation Interferometrie und Schwingquarzmikrowaage mit Ableitung. Langmuir, (2008) Am 18. März; 24(6): 2509-18. Epub (2008) Am 16. Februar.
6. Weg T.J., FletcherW. R., Gormally, M.V., Johal M.S., Doppel-Träger Polarisations-Interferometrie Löst Mechanistische Aspekte der Polyelektrolyt-Aufnahme. Langmuir, (2008) SO BALD WIE MÖGLICH Artikel, Selennetz-Freigabetermin: Am 10. September (2008).
7. Swann M.J., Freeman New Jersey, Carrington S., Ronan G., Barrett P., Strukturwandel und Stöchiometrie von Protein-Interaktionen Unter Verwendung des Größen-und Dichte-Ein Profil erstellens Mengenmäßig Bestimmend. Schreiben in der Peptid-Wissenschaft (2003) 10 487-494.
8. Unter Verwendung des van't Hoff und Eyring-Gleichungen.
9. Boudjemline A., Clarke D.T., Freeman New Jersey, Nicholson J.M., Jones G.R., Anfangsstadien der Proteinkristallisation, wie durch auftauchende optische Hohlleitertechnologie J. Appl aufgedeckt. Cryst. (2008). 41, 523-530. doi: 10.1107/S0021889808005098.
10. Mashaghi A., Swann M., Popplewell J., Textor M., Reimhult E., Optische Anisotrophie von den unterstützten Lipidzellen geprüft durch Hohlleiterspektroskopie und seine Anwendung zur Studie der unterstützten Lipid bilayer Entstehungskinetik, Anal. Chem., 80 (10), 3666-3676, (2008). PMID: Freigabetermin des Selennetz-18517221: 19, Apr. (2008); (Artikel) DOI: 10.1021/ac800027s.
11. Sanghera N., Swann M.J., Ronan G., Pinheiro T.J., Einblick in frühe Ereignisse in der Anhäufung des Prionsproteins auf Lipidmembranen, Biochimica und Biophysica-Acta (BBA) - Biomembranes, Volumen 1788, Punkt 10, Oktober (2009), Seiten 2245-2251.

Copyright AZoNano.com, Dr. Gerry Ronan (Farfield Gruppe)

Date Added: Feb 14, 2010 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 23:13

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