El Contar, Apresto y Agregación de Visualización en Proteínas Usando Análisis Que Sigue Su Trayectoria del Nanoparticle

Por AZoNano

Temas Revestidos

Introducción
Agregados de la Proteína de la Proyección De Imagen
Revestimiento de la Gama de Tallas del Agregado de la Proteína
Submarino 30 Agregados del nanómetro
Rango de 30 - de 1000 nanómetro

Introducción

Caracterizar el estado de la agregación en proteínas es de importancia suprema al intentar entender estabilidad y eficacia del producto. La calidad del Producto, en términos de poder de la actividad biológica y de la inmunogeneticidad, sea influenciada altamente por el estado de la agregación de la proteína. La agregación de la Proteína puede ocurrir en todos los pasos de progresión en el proceso de fabricación (cultivo celular, purificación y formulación) y por lo tanto, determinando el estado de la agregación, la modificación/la optimización del proceso puede ser lograda.

Un nuevo nanoparticle laser-basado que sigue su trayectoria el sistema de análisis está ahora disponible que permite partículas del nanoscale, tales como proteína agrega, visualizar directamente e individualmente y contado en líquido en el tiempo real, del cual los perfiles de alta resolución de la distribución dimensional de partícula pueden ser obtenidos. La técnica es costo rápido, robusto, exacto y bajo que representa una opción atractiva o un complemento a los métodos existentes de análisis del nanoparticle tales como Dispersión Luminosa Dinámica, DLS (también conocido como Espectroscopia de la Correlación del Fotón, PCS) o Microscopia Electrónica (EM).

Agregados de la Proteína de la Proyección De Imagen

El instrumento de NanoSight ofrece discernimiento único en la agregación de la proteína en el rango de 30 nm-1000 nanómetro.

Cuadro 1. Una imagen típica produjo por la técnica de NanoSight. La imagen permite que los utilizadores reconozcan inmediatamente ciertas características sobre su muestra.

Cuadro 2. distribución dimensional de Partícula (distribución del número) producida de la muestra mostrada en el Cuadro 1.

Revestimiento de la Gama de Tallas del Agregado de la Proteína

Varias técnicas se han utilizado Históricamente para caracterizar las proteínas y la agregación de la proteína. Las técnicas de separación se utilizan A Menudo para discriminar las proteínas y los agregados de la proteína, con el análisis adicional realizado en una muestra separada.

Técnicas Analíticas:

Técnicas de Separación:

  • Cromatografía de la Exclusión de la Talla (SEC)
  • Fraccionamiento de Flujo de Campo (FFF)
  • Electroforesis Capilar. (CE)
  • Ultracentrifugación Analítica (AUC)

Submarino 30 Agregados del nanómetro

Es común encontrar el SEC emparejado con DLS, las ALAMEDAS o espectroscopia ULTRAVIOLETA. La Cromatografía de la Exclusión de la Talla se puede utilizar para separar los monómeros de la proteína de los agregados. El análisis Subsiguiente usando DLS por ejemplo, puede producir talla exacta/el análisis del peso molecular para las fracciones purificadas. Encima del límite de exclusión de la olumna del SEC no hay separación y por lo tanto abulta los sistemas de análisis tales como DLS llega a estar menos bien adaptado. El análisis de las ALAMEDAS puede ayudar a reducir el efecto de agregados más grandes en muestras no-fraccionadas pero la técnica requiere la interpretación.

Rango de 30 - de 1000 nanómetro

La técnica de NanoSight permite que los agregados de la proteína dentro de la gama de tallas de 30 - 1000 nanómetro sean individualmente reflejados y clasificados siguiendo su trayectoria su movimiento Browniano sobre una base de la partícula-por-partícula. el análisis de la Partícula-por-Partícula permite que las distribuciones de alta resolución del número sean generadas. Esta región a menudo es servida mal por DLS con la alta concentración de monómero de la proteína y el número inferior de agregados grandes, brillantes que dominan a menudo la señal.

Mientras Que el fraccionamiento se puede realizar por ejemplo con FFF al análisis del ayudante DLS, la dilución que se requiere a menudo para FFF puede hacer a este undesirable de la ruta debido al potencial para la agregación adicional. Además, la dilución de estos agregados “de tamano medio” los toma a menudo debajo del límite de la sensibilidad para DLS. La técnica de Nanosight no requiere con frecuencia ninguna dilución mientras que los 30-1000 agregados de la proteína del nanómetro caen a menudo dentro del rango de concentración óptimo para esta técnica.

El límite cortado de la técnica de NanoSight (30 nanómetro para los agregados de la proteína) significa que está bien adaptado complementar SEC/DLS o SEC/UV encima del límite de exclusión de SEC. El límite superior de la técnica de NanoSight representa la punta en la cual las únicas técnicas convencionales de la proyección de imagen/del oscurecimiento de la partícula llegan a ser aplicables.

Sin la separación anterior de agregados, DLS produciría típicamente un resultado bimodal para la muestra agregada mostrada en el Cuadro 3. El pico primario cerca formado del gran número de partículas monoméricas, mientras que el pico secundario sería formado por los agregados muy grandes que dispersan intensidades importantes de la luz. Un análisis mal resuelto de DLS mostraría que ningunas partículas entre estas puntas a pesar de su existencia como las partículas monoméricas primarias y los pocos agregados más grandes dominarían la señal.

El Cuadro 3. Imagen produjo por el instrumento de Nanosight LM10-HS que mostraba una muestra pesado agregada de la proteína.

Mientras Que la técnica de NanoSight no podría medir la talla monomérica primaria pues las partículas caerían debajo del límite de detección de la técnica, encima de 30 nanómetro, la técnica proporciona al análisis de la partícula-por-partícula de los agregados de la proteína, formando únicamente una distribución de alta resolución del número de partículas agregadas.

Cuadro 4. Una representación de la distribución de los tamaños de las partículas que se pueden contener dentro de una muestra agregada de la proteína.

Esta información ha sido originaria, revisada y adaptada de los materiales proporcionados por NanoSight.

Para más información visite por favor NanoSight.

Date Added: Dec 22, 2009 | Updated: Mar 7, 2013

Last Update: 7. March 2013 09:29

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