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Mediante microscopía óptica de los objetos de imagen con resoluciones de hasta 0,5 nanómetros

Published on July 14, 2010 at 8:01 PM

La sabiduría convencional sostiene que la microscopía óptica no se puede utilizar para "ver" algo tan pequeño como una molécula individual. Pero la ciencia ha volcado una vez más la sabiduría convencional. Secretario de Energía, premio Nobel y ex director del Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley (Berkeley Lab) , Steven Chu, dirigió el desarrollo de una técnica que permite el uso de microscopía óptica a los objetos de la imagen o la distancia entre ellos con resoluciones tan pequeños como 0.5 nanómetros - la mitad de una milmillonésima de un metro, o un orden de magnitud menor que el mejor anterior.

El gráfico de la izquierda muestra que con el sistema de captación activa de allí se deriva una resolución de alrededor de 0,3 píxeles o 19 nanómetros, pero con el sistema de retroalimentación en la resolución se mantiene en mejor que el 0,01 píxeles, o alrededor de 0,64 nanómetros. Imagen de la derecha muestra la persona cianina (Cy) moléculas fluorescentes de color - Cy3 y Cy5 - utilizado para etiquetar 20 pares de bases del ADN de doble cadena.

"La posibilidad de obtener sub-nanométrica resolución en ambientes acuosos biológicamente relevantes tiene el potencial de revolucionar la biología, en particular la biología estructural", dijo el secretario Chu. "Una de las motivaciones para este trabajo, por ejemplo, fue para medir las distancias entre las proteínas que se forman de varios dominios, estructuras altamente complejas, como el conjunto de proteínas que forma la polimerasa de ARN II humanos del sistema, que inicia la transcripción del ADN."

Secretario Chu es el co-autor de un artículo que aparece hoy en la revista Nature que describe esta investigación. El documento se titula "Subnanometre una sola molécula de la localización, registro y medición de distancia." Los otros autores son Alexandros Pertsinidis, un investigador post-doctoral y miembro del grupo de investigación de Chu de la Universidad de California (UC) en Berkeley, quien ahora es profesor asistente en el Instituto Sloan-Kettering, y Yunxiang Zhang, miembro de la investigación de Chu grupo de la Universidad de Stanford.

De acuerdo con una ley de la física conocida como el "límite de difracción", la imagen más pequeña que un sistema óptico puede resolver es la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada para producir la imagen. Para la óptica convencional, lo que corresponde a alrededor de 200 nanómetros. En comparación, una molécula de ADN mide aproximadamente 2.5 nanómetros de ancho.

Mientras que los no-ópticos sistemas de imágenes, tales como microscopios electrónicos, se puede resolver bien los objetos en la escala subnanometer, estos sistemas operan en condiciones no ideales para el estudio de muestras biológicas. Detección de marcadores fluorescentes individuales unidos a las moléculas biológicas de interés, utilizando dispositivos de carga acoplada (CCD) - matrices de chips de silicio que convierten la luz entrante en una carga eléctrica, se ha producido resoluciones tan finas como de cinco nanómetros. Sin embargo, hasta ahora esta tecnología ha sido incapaz de moléculas de una sola imagen o las distancias entre un par de moléculas mucho menos de 20 nanómetros.

Chu y sus co-autores fueron capaces de utilizar el mismo CCD-fluorescencia tecnología para resolver las distancias con precisión y exactitud subnanometer mediante la corrección de un truco de la luz. Las cargas eléctricas en un CCD se crean cuando los fotones de silicio de la huelga y desalojar a los electrones, con la fuerza de la carga es proporcional a la intensidad de los fotones incidentes. Sin embargo, dependiendo precisamente donde un fotón incide sobre la superficie de un chip de silicio, no puede haber una ligera diferencia en la forma en que el fotón es absorbido y si se genera una carga mensurable. Esta falta de uniformidad en la respuesta de la matriz CCD de silicio a los fotones entrantes, lo que es probablemente un artefacto del proceso de fabricación de chips, se traduce en una confusión de píxeles que hace que sea difícil de resolver dos puntos que están dentro de unos pocos nanómetros de unos a otros .

"Hemos desarrollado un sistema de información activa que nos permite colocar la imagen de una molécula fluorescente única en cualquier parte del CCD con una precisión sub-pixel, que a su vez nos permite trabajar en una región más pequeña que la típica de tres píxeles escala de longitud de la CCD no uniformidad ", dice Pertsinidis, quien es el autor principal del artículo de Nature. "Con este sistema de retroalimentación más el uso de rayos ópticos adicionales para estabilizar el sistema de microscopio, se puede crear una región de calibrado de la matriz de silicio donde se reduce el error debido a la falta de uniformidad a 0,5 nanómetros. Al colocar las moléculas que se quiere medir en el centro de esta región, podemos obtener una resolución subnanometer usando un microscopio óptico convencional que se puede encontrar en cualquier laboratorio de biología. "

Chu dice que la capacidad de mover el escenario de un pequeño microscopio distancias y calcular el centro geométrico (centroide) de la imagen hace posible no sólo para medir la respuesta fototérmica falta de uniformidad entre los píxeles, sino también para medir la falta de uniformidad dentro de cada píxel individual.

"Sabiendo esto no uniformidad luego nos permite hacer las correcciones entre la posición aparente y la posición real del centro de gravedad de la imagen", dice Chu. "Como esta respuesta no uniforme se basa en la matriz CCD y no cambia de día a día, nuestro sistema de información activa que nos permite la imagen varias veces en la misma posición de la matriz CCD."

Pertsinidis es seguir trabajando con Chu y otros miembros del grupo en el desarrollo y la aplicación de esta técnica de super-resolución. Además de los humanos la ARN polimerasa II del sistema, él y el grupo lo está utilizando para determinar la estructura de las moléculas de cadherina epitelial que son responsables de la adhesión célula-célula que contiene tejidos y otros materiales biológicos en conjunto. Pertsinidis, Zhang, investigador postdoctoral y otro en el grupo de investigación de Chu, Sang Ryul Park, también están utilizando esta técnica para crear mediciones 3D de la organización molecular dentro de las células del cerebro.

"La idea es determinar la estructura y la dinámica del proceso de fusión de vesículas que libera las moléculas de neurotransmisor utilizado por las neuronas para comunicarse entre sí", dice Pertsinidis. "En estos momentos estamos recibiendo las mediciones in situ con una resolución de unos 10 nanómetros, pero creemos que puede empujar a la presente Resolución al plazo de dos nanómetros."

En colaboración con Joe Gray, director asociado del Laboratorio de Berkeley de ciencias de la vida y un investigador de cáncer más importantes, postdoctorados en el grupo de investigación de Chu también está usando la técnica de resolución de súper-para estudiar la unión de moléculas de señalización de la proteína RAS que se ha relacionado con una serie de cánceres, incluyendo los de mama, páncreas, pulmón y colon. Esta investigación podría ayudar a explicar por qué terapias contra el cáncer que se desempeñan bien en algunos pacientes no son efectivos en otros.

Además de sus aplicaciones biológicas, Pertsinidis, Zhang y Chu, en su artículo de Nature dice que su super-resolución técnica también podría ser de utilidad para la caracterización y diseño de sistemas de precisión fotométrica de imágenes en la física atómica o la astronomía, y permiten las nuevas herramientas de litografía óptica y nanometrología .

Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Nacional de Ciencias, la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio, y la Defense Advanced Agencia de Proyectos de Investigación.

Last Update: 6. October 2011 18:23

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