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Usando la microscopia ottica di oggetti immagini con risoluzioni più piccolo 0,5 nanometri

Published on July 14, 2010 at 8:01 PM

La saggezza popolare sostiene che la microscopia ottica non può essere usato per "vedere" qualcosa di piccolo come una singola molecola. Ma la scienza ancora una volta ha ribaltato la saggezza convenzionale. Segretario per l'energia, premio Nobel ed ex direttore del Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) Steven Chu ha portato allo sviluppo di una tecnica che consente l'utilizzo di microscopia ottica per gli oggetti immagine o la distanza tra loro con risoluzioni più piccolo di 0,5 nanometri - la metà di un miliardesimo di metro, o un ordine di grandezza più piccola della migliore precedente.

Il grafico a sinistra mostra che con il sistema di feedback attivo fuori c'è una deriva risoluzione di circa 0,3 pixel o 19 nanometri, ma con il sistema di feedback sulla risoluzione è mantenuta a migliore dello 0,01 pixel, ovvero circa 0,64 nanometri. Immagine sulla destra mostra individuale Cyanine (Cy) molecole di colorante fluorescente - Cy3 e Cy5 - usato per etichettare 20 paia di basi di DNA a doppia elica.

"La possibilità di ottenere risoluzione sub-nanometrica in ambienti acquosi biologicamente rilevanti ha il potenziale per rivoluzionare la biologia, in particolare della biologia strutturale", dice il segretario Chu. "Una delle motivazioni per questo lavoro, per esempio, è stato quello di misurare le distanze tra le proteine ​​che formano multi-dominio, strutture altamente complesse, come l'assemblea proteina che forma l'umano RNA polimerasi II sistema, che inizia la trascrizione del DNA."

Segretario Chu è il co-autore di un articolo che appare oggi sulla rivista Nature che descrive questa ricerca. Il documento è intitolato "Subnanometre singola molecola di localizzazione, registrazione e misure di distanza." Gli altri autori sono Alexandros Pertsinidis, un post-dottorato, ricercatore e membro del gruppo di ricerca Chu presso la University of California (UC) Berkeley, che è ora professore assistente presso la Sloan-Kettering Institute, e Yunxiang Zhang, membro della ricerca Chu gruppo della Stanford University.

Secondo una legge della fisica conosciuta come "limite di diffrazione," la più piccola immagine che un sistema ottico in grado di risolvere è circa la metà della lunghezza d'onda della luce utilizzata per la produzione di tale immagine. Per le ottiche convenzionali, ciò corrisponde a circa 200 nanometri. In confronto, una molecola di DNA misure di circa 2,5 nanometri di larghezza.

Mentre i non-ottici sistemi di imaging, come microscopi elettronici, in grado di risolvere oggetti così nella scala subnanometer, questi sistemi di operare in condizioni non ideali per lo studio di campioni biologici. Rilevare singole etichette fluorescenti attaccati alle molecole biologiche di interesse utilizzando i dispositivi ad accoppiamento di carica (CCD) - array di chip di silicio, che convertono la luce in entrata in una carica elettrica, ha dato risoluzioni fine come cinque nanometri. Tuttavia, fino ad oggi questa tecnologia è stata in grado di molecole singola immagine o le distanze tra una coppia di molecole molto meno di 20 nanometri.

Chu ei suoi co-autori sono stati in grado di utilizzare la stessa tecnologia CCD-fluorescenza per risolvere distanze con precisione e accuratezza subnanometer correggendo un trucco della luce. Le cariche elettriche in un array di CCD vengono creati quando i fotoni colpiscono il silicio e rimuovere gli elettroni, con la forza della carica è proporzionale all'intensità dei fotoni incidenti. Tuttavia, a seconda esattamente dove un fotone colpisce la superficie di un chip di silicio, non ci può essere una leggera differenza nel modo in cui il fotone viene assorbito e se si genera una carica misurabile. Questa non uniformità nella risposta del CCD silicio per fotoni in arrivo, che è probabilmente un artefatto del processo di produzione dei chip, si traduce in una sfocatura di pixel che rende difficile risolvere due punti che si trovano a pochi nanometri l'uno dall'altro .

"Abbiamo sviluppato un sistema attivo di feedback che ci permette di posizionare l'immagine di una singola molecola fluorescente in qualsiasi punto della CCD con precisione sub-pixel, che a sua volta ci consente di lavorare in una regione più piccolo del tipico composto da tre pixel di lunghezza scala del CCD non uniformità ", dice Pertsinidis, che è l'autore principale sulla carta Natura. "Con questo sistema di feedback, più l'uso di ulteriori travi ottico per stabilizzare il sistema microscopio, possiamo creare una regione calibrato sulla matrice di silicio in cui è ridotta l'errore a causa della non uniformità di 0,5 nanometri. Inserendo le molecole vogliamo misurare nel centro di questa regione siamo in grado di ottenere la risoluzione subnanometer utilizzando un microscopio convenzionale ottico che si possono trovare in qualsiasi laboratorio di biologia. "

Chu dice che la capacità di spostare il palco di un piccolo microscopio distanze e calcolare il centro geometrico (centroide) dell'immagine consente di misurare non solo la foto-risposta non uniformità tra i pixel, ma anche per misurare la non uniformità all'interno di ogni singolo pixel.

"Sapendo questo non uniformità consente poi a noi per fare le correzioni tra la posizione apparente e la posizione reale del centroide dell'immagine", spiega Chu. "Dal momento che questo non uniforme risposta è integrato nel CCD e non cambia di giorno in giorno, il nostro sistema di feedback attivo ci permette di immagine ripetutamente nella stessa posizione del CCD."

Pertsinidis sta continuando a lavorare con Chu e altri del gruppo sull'ulteriore sviluppo e l'applicazione di questa super-risoluzione tecnica. In aggiunta all'essere umano RNA polimerasi II sistema, lui e il gruppo lo usano per determinare la struttura delle molecole caderina epiteliale che sono responsabili della cellula-cellula che contiene l'adesione dei tessuti ed altri materiali biologici insieme. Pertsinidis, Zhang, e un altro postdoc nel gruppo di ricerca Chu, Ryul Sang Park, anche utilizzando questa tecnica per creare le misurazioni 3D della organizzazione molecolare all'interno delle cellule cerebrali.

"L'idea è quella di determinare la struttura e le dinamiche del processo di fusione delle vescicole che rilascia le molecole di neurotrasmettitore utilizzato dai neuroni per comunicare tra loro", dice Pertsinidis. "In questo momento ci stiamo misure in situ con una risoluzione di circa 10 nanometri, ma pensiamo di poter spingere la presente risoluzione entro due nanometri."

In una collaborazione con Joe Gray, direttore associato di Berkeley Lab per scienze della vita e un ricercatore del cancro leader, dottori di ricerca nel gruppo di ricerca Chu sono anche usando il super-risoluzione tecnica per studiare l'attaccamento di molecole di segnalazione sulla proteina RAS, che è stato collegato a un certo numero di tumori, compresi quelli della mammella, pancreas, del polmone e del colon. Questa ricerca potrebbe aiutare a spiegare perché le terapie del cancro che ottengono buoni risultati su alcuni pazienti sono inefficaci sugli altri.

Oltre alle sue applicazioni biologiche, Pertsinidis, Zhang e Chu nel loro articolo Nature dicono che il loro super-risoluzione tecnica dovrebbe anche rivelarsi prezioso per la caratterizzazione e la progettazione di sistemi di imaging fotometrici precisione nel campo della fisica atomica o l'astronomia, e permettono di nuovi strumenti di litografia ottica e nanometrologia .

Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health, la National Science Foundation, la National Aeronautics and Space Administration, e l'Advanced Research Projects Agency Difesa.

Last Update: 8. October 2011 07:27

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